楊曉喻 李世軼 張迪 吳穎 楊濤 劉長虹

南方醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院·廣東省口腔醫(yī)院種植中心，廣州 510280

種植體表面良好的處理，有利于盡快實現(xiàn)骨整合，從而履行功能。以往的種植體表面處理研究主要集中在種植體表面的物理化學(xué)處理，而基因水平的生物化學(xué)處理較為少見。人骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）具有獨特的誘導(dǎo)成骨活性[1]。其中，BMP2的誘導(dǎo)成骨活性最強，可促進(jìn)Ca、P在鈦金屬表面沉積，提高種植體-骨界面結(jié)合率，加快骨結(jié)合進(jìn)程。殼聚糖（chitosan，CS）[2]作為一種非病毒載體，是自然界中唯一一種帶陽離子的可降解納米級載體，具有良好的生物相容性、可降解性和黏膜黏附性，特別適合包載蛋白質(zhì)、多肽、疫苗和基因等生物活性大分子[3-5]。本研究利用基因重組技術(shù)在體外構(gòu)建人BMP2基因的真核表達(dá)重組質(zhì)粒，并采用去溶劑法合成殼聚糖/質(zhì)粒納米復(fù)合體，為后續(xù)基因轉(zhuǎn)染形成活性因子激活成骨信號通道以加快種植體周成骨的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

pMD18T-hBMP2-His（帶有組氨酸標(biāo)簽的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2模板質(zhì)粒，北京義翹神州生物技術(shù)公司），p IRES2-EGFP（攜帶有增強型綠色熒光蛋白的真核表達(dá)載體，含卡那霉素抗性基因，Clontech公司，美國），感受態(tài)大腸桿菌DH5α（Promega公司，美國），限制性內(nèi)切酶（Takara公司，日本），T4 DNA連接酶（NEB公司，美國），質(zhì)粒抽提試劑盒（Qiagen公司，美國）， DNA引物合成及測序（Invitrogen公司，美國），核酸蛋白分析儀（Implen公司，德國），ZetaPALS電位及粒度分析儀（Brookhaven公司，美國），原子力顯微鏡MFP-3D（Asylum Research公司，美國）。殼聚糖：A組（相對分子質(zhì)量98.8×103，脫乙酰度87.31%）、B組（相對分子質(zhì)量121×103，脫乙酰度91.48%）、C組（相對分子質(zhì)量77.8×103，脫乙酰度97.37%）（上?？ú┕べQ(mào)有限公司），D組（相對分子質(zhì)量379×103，脫乙酰度93.9%）（Sigma公司，美國），E組（相對分子質(zhì)量17×103，脫乙酰度79%）（日本慶應(yīng)大學(xué)實驗室提供）。

1.2 p IRES2-EGFP-hBMP2-His重組質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定及測序

1.2.1 p IRES2-EGFP-hBMP2-His重組質(zhì)粒的構(gòu)建p IRES2-EGFP和pMD18T-hBMP2-His雙酶切及目的片段回收：取p IRES2-EGFP載體質(zhì)粒和經(jīng)PCR擴增并加載雙酶切位點的pMD 18T-hBMP2-His質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ、EcoRⅠ在37 ℃水浴雙酶切反應(yīng)2 h，切取目的條帶，分別將含目的片段的瓊脂糖凝膠經(jīng)DNA純化回收試劑盒回收。

p IRES2-EGFP-hBMP2-His真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建：取經(jīng)BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切的pIRES2-EGFP大片段以及經(jīng)BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切的目的基因hBMP2-His片段加入T4 DNA連接酶，22 ℃反應(yīng)2 h。

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)菌DH5α中，取100 μL均勻涂布于含50 μg·m L-1卡那霉素的LB平板上，室溫放置涂好的平板直至液體被完全吸收，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜，可見菌落出現(xiàn)。

1.2.2 p IRES2-EGFP-hBMP2-His重組質(zhì)粒的鑒定及測序 挑取菌落進(jìn)行搖菌擴增，質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切，0.6%瓊脂糖凝膠電泳（120 V，25 m in）鑒定。陽性克隆可酶切出1 209 bp大小的片段。將鑒定正確的重組克隆送Invitrogen公司進(jìn)行測序驗證，測序引物為通用引物CMV-F。在www.ncbi.nlm.nih.gov上通過BLAST程序?qū)λ鶞y得序列與GenBank的BMP2基因同源序列進(jìn)行比較。

1.3 CS/pIRES2-EGFP-hBMP2-His納米復(fù)合體的制備及檢測

1.3.1 去溶劑法制備CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His納米復(fù)合體 分別稱取一定量的5種不同相對分子質(zhì)量及脫乙酰度的殼聚糖（A～E組），溶解于體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸，使終濃度為0.2 mg·m L-1，NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.5，0.22 μm濾膜過濾，置于4 ℃冰箱待用。p IRES2-EGFP-hBMP2-His質(zhì)粒溶于20%的Na2SO4溶液。按N/P（殼聚糖中的胺基含量與質(zhì)粒中磷酸基含量的摩爾比）=1、3、5、7、10分別將55 ℃預(yù)熱殼聚糖與pIRES2-EGFP-hBMP2-His混合，渦旋30 s，靜置30 m in，即為CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His納米復(fù)合體混懸液。

1.3.2 CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His納米復(fù)合體的粒徑及Zeta電位檢測 取N/P=3、5、7、10的納米復(fù)合體懸液，用1%pH 6.5乙酸溶液稀釋納米復(fù)合體至適當(dāng)濃度及體積，ZetaPALS電位及粒度分析儀檢測納米復(fù)合體的粒徑大小、分布及Zeta電位。

1.3.3 CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His納米復(fù)合體凝膠電泳實驗及包封率測定 取裸質(zhì)粒DNA及不同N/P比值（N/P=1、3、5、7、10）納米復(fù)合體懸液10 μL，行0.6%瓊脂糖凝膠電泳（120 V，25 m in）分析。

取C組200 μL pH6.5殼聚糖按照N/P=5與pIRES2-EGFP-hBMP2-His反應(yīng)形成納米復(fù)合體，低溫離心30 m in（4℃，15000 g）。小心吸取上清液，TNE緩沖液（1.21 g Tris，5.84 g NaCl，0.37 g EDTA，定容至1 L，pH=7.4）定容至1 m L，再加入濃度為0.15 μg·m L-1的Hoechst33258染液1 m L，熒光分光法測定熒光強度（F），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計算溶液中質(zhì)粒DNA濃度（c），按下式計算包封率 ：包封率（%）=（W總-W上清) /W總×100% ，其中W總為總pDNA 量，W上清為上清液中pDNA量。重復(fù)實驗3次，取平均值。

1.3.4 CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His納米復(fù)合體形貌觀察 取N/P=5的CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His納米復(fù)合體懸液，滴于新剝離的云母片上，分散均勻，過夜使其自然干燥，原子力顯微鏡觀察納米復(fù)合體的形貌。設(shè)置空白云母片組及N/P=10組作為對照。

2 結(jié)果

2.1 p IRES2-EGFP-hBMP2-His重組質(zhì)粒的鑒定以及測序

p IRES2-EGFP-hBMP2-His重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切后，可見載體片段（5 308 bp）及目的基因片段（1 209 bp），酶切結(jié)果正確（圖1），表明經(jīng)轉(zhuǎn)化、擴增、抽提后的質(zhì)粒為目的質(zhì)粒。經(jīng)基因序列測定及分析后未見突變，p IRES2-EGFP-hBMP2-His重組質(zhì)粒與GenBank的BMP2基因同源序列的比較表明，與人BMP2基因具有高度同源性。

圖1 p IRES2-EGFP-hBMP2-His經(jīng)EcoRⅠand BamHⅠ雙酶切Fig 1 p IRES2-EGFP-hBMP2-His plasm id digested by EcoRⅠand BamHⅠ

2.2 CS/pIRES2-EGFP-hBMP2-His納米復(fù)合體粒徑大小、分布及Zeta電位檢測

不同N/P比值下各組CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His納米復(fù)合體的粒徑大小見表1。從表1可見，5組殼聚糖在不同N/P比情況下均能與p IRES2-EGFP-hBMP2-His質(zhì)粒復(fù)合形成納米復(fù)合體，粒徑111.7～3 214.2 nm不等，A、B、C組在N/P≥5時及D、E組在每個N/P比情況下均可以形成兩種不同粒徑大小的納米復(fù)合體。納米復(fù)合體的粒徑主要集中在兩個區(qū)域范圍，形成兩個峰值，粒徑較小的納米復(fù)合體數(shù)量較多，粒徑較大的復(fù)合體數(shù)量較少（圖2）。

表1 不同N/P比值下各組CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His納米復(fù)合體粒徑的大小Tab 1 Size of CS/p IRES2-EGFP-hBM P2-His nanoparticles under various N/P ratio in different groups±s,n=10, nm

表1 不同N/P比值下各組CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His納米復(fù)合體粒徑的大小Tab 1 Size of CS/p IRES2-EGFP-hBM P2-His nanoparticles under various N/P ratio in different groups±s,n=10, nm

圖2 C組CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His納米復(fù)合體粒徑的分布（N/P=5）Fig 2 Distribution of CS/pIRES2-EGFP-hBMP2-His nanoparticles of group C（N/P=5）

5組CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His納米復(fù)合體的Zeta電位4.93～16.79 mV不等（表2），并且，隨著N/P比的增加，納米復(fù)合體表面Zeta電位呈上升趨勢且趨于穩(wěn)定。

表2 不同N/P比值下各組CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His納米復(fù)合體表面Zeta電位大小Tab 2 Zeta potential of CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His nanoparticles under various N/P ratio in different groups , n=10, m V±s

表2 不同N/P比值下各組CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His納米復(fù)合體表面Zeta電位大小Tab 2 Zeta potential of CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His nanoparticles under various N/P ratio in different groups , n=10, m V±s

2.3 CS/pIRES2-EGFP-hBMP2-His納米復(fù)合體的包封率測定

不同N/P比值的納米復(fù)合體凝膠電泳分析結(jié)果見圖3。當(dāng)N/P≥3時，殼聚糖對p IRES2-EGFP-hBMP2-His完全包裹。C組CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His納米復(fù)合體的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為F=224.66c+239.43，包封率為（96.03±0.25）%。

圖3 不同N/P比值的CS/pIRES2-EGFP-hBMP2-His納米復(fù)合體凝膠電泳分析Fig 3 Agarose electrophoresis of CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His nanoparticles at different N/P ratios

2.4 CS/pIRES2-EGFP-hBMP2-His納米復(fù)合體的形貌

原子力顯微鏡下可見，空白云母片呈均勻狀，背景較為清晰（圖4A）；N/P=5時，殼聚糖與p IRES2-EGFP-hBMP2-His質(zhì)粒復(fù)合后形成球狀的CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His納米復(fù)合體結(jié)構(gòu)（圖4B）；N/P=10時，球狀的納米復(fù)合體部分聚集形成較大的聚集體（圖4C）。

圖4 不同N/P比值的CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His納米復(fù)合體形貌的原子力顯微鏡觀察Fig 4 Morphology of CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His nanoparticles by atomic force microscope

3 討論

目的基因要在轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，首先取決于目的基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建[6]。p IRES2-EGFP作為基因表達(dá)的載體，復(fù)制能力強，具有多克隆位點，便于目的基因片段插入，并且含有高效且功能強大的CMV啟動子，可以使目的基因在多種類型細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)活性。此外，該載體攜帶增強型綠色熒光蛋白基因，當(dāng)攜帶外源性基因進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯基因產(chǎn)生綠色熒光蛋白，該蛋白強度較普通綠色熒光蛋白強幾十倍，有利于鏡下觀察檢測分析目的基因的轉(zhuǎn)染效率。由此可見p IRES2-EGFP具有生物活性、無細(xì)胞毒性、不影響融合蛋白表達(dá)、熒光效果穩(wěn)定、檢測方便的優(yōu)點。

在基因治療中，攜帶靶基因的載體復(fù)合體粒徑是基因微粒分散遞送系統(tǒng)的一個重要影響因素，可以直接影響分散系統(tǒng)在細(xì)胞表面的吸附、吞噬及胞內(nèi)釋放。小于100 nm的粒子不易黏附于細(xì)胞表面，較大粒徑的微粒因組織擴散和入胞受限影響轉(zhuǎn)染效率，而100～300 nm范圍內(nèi)的納米微粒相對來說較容易通過細(xì)胞的胞吞作用進(jìn)入胞內(nèi)，從而釋放目的基因作用于靶細(xì)胞[7]。

殼聚糖與目的基因的結(jié)合通常采用共價交聯(lián)法、離子誘導(dǎo)法等[8]，本研究中殼聚糖與p IRES2-EGFP-hBMP2-His質(zhì)粒復(fù)合形成納米復(fù)合體采用的是去溶劑法。該方法合成工藝簡單，條件溫和，不會破壞基因和蛋白質(zhì)，且制備的納米粒徑小，穩(wěn)定性較好。弱酸性溶液中的殼聚糖部分質(zhì)子化呈帶正電荷狀態(tài)，當(dāng)加入帶有負(fù)電荷的p IRES2-EGFP-hBMP2-His時，二者通過靜電作用結(jié)合形成納米復(fù)合體，并由于溶液Na2SO4電解質(zhì)的存在，使得高分子物質(zhì)從溶液中析出，最終形成納米粒。在殼聚糖與質(zhì)?；蜻M(jìn)行復(fù)合的時候，存在一定的N/P比，即殼聚糖中的胺基與基因中磷酸基的摩爾比。當(dāng)殼聚糖與質(zhì)粒按照N/P=1復(fù)合時，加入殼聚糖的量不足以與所加入的質(zhì)粒量充分結(jié)合，遂導(dǎo)致凝膠電泳時游離的質(zhì)粒在電泳槽中由負(fù)極向正極移動，而當(dāng)N/P≥3時，殼聚糖攜帶的正電荷對質(zhì)?；蛴型耆东@能力[9-11]。

此外，本實驗中在測定各組納米復(fù)合體粒徑大小時發(fā)現(xiàn)，相對分子質(zhì)量17×103～379×103、脫乙酰度79%～97.31%的殼聚糖在N/P≥3的情況下均可以與目的質(zhì)粒結(jié)合形成納米粒。在納米復(fù)合體粒徑檢測中發(fā)現(xiàn)，每組粒徑分布幾乎都會出現(xiàn)雙峰，其中主峰粒徑較小，數(shù)量較多，這在以往文獻(xiàn)中未見報道。該雙峰現(xiàn)象是因為殼聚糖與基因復(fù)合過程中，納米微粒帶表面電荷，并且受到微粒在溶液中布朗運動的影響，一些粒徑較小的納米微粒在溶液中呈不穩(wěn)定狀態(tài)，在團聚效應(yīng)作用下形成較大粒徑的復(fù)合體。

殼聚糖/DNA納米復(fù)合體的構(gòu)建受多種因素如相對分子質(zhì)量大小、脫乙酰度、pH值、N/P比等的影響[12-15]，探討CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His的構(gòu)建工作具有重要的意義。今后的研究將進(jìn)一步探索影響殼聚糖作為基因載體的多項因素，并進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染的生物實驗，以驗證和檢測殼聚糖作為基因載體的生物安全性以及轉(zhuǎn)染效率，研究如何對殼聚糖進(jìn)行改性或接枝以及模擬種植體表面的生物界面，為種植體周圍快速成骨提供基礎(chǔ)研究。

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