賈嘉元等

摘要：從禽肉加工廠的污泥中分離到174株能在牛奶瓊脂平板產(chǎn)透明圈微生物菌株，其中42株具有分解羽毛的能力，從中篩選出13株具有較強羽毛降解能力的菌株，均能在48 h內(nèi)將羽毛完全分解。16S rDNA的BLAST比對及系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果顯示，8株菌為寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas），1株菌為芽孢桿菌屬（Bacillus），4株菌為氣單胞菌屬（Aeromonas）。

關(guān)鍵詞：羽毛降解菌；16S rDNA；發(fā)育樹

中圖分類號：Q939.9文獻標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2014）02-0068-04

羽毛是養(yǎng)殖業(yè)的廢棄物，但同時又是一種很好的飼料蛋白原料和化工資源。我國每年的羽毛總量超過100萬噸[1]，而且隨著集約化養(yǎng)殖的快速發(fā)展，產(chǎn)量逐年增加。羽毛主要成分是角蛋白質(zhì)，其半胱氨酸形成高度交聯(lián)的二硫鍵，難以被普通蛋白水解酶分解，如果不經(jīng)過處理動物很難消化和利用[2]。常規(guī)處理羽毛的方式為酸堿水解或高溫高壓蒸煮，耗能高而且易引起嚴重環(huán)境污染。自然界中的某些微生物能分泌角蛋白酶將角蛋白質(zhì)緩慢分解，因此篩選具有高效分解羽毛能力的微生物一直是該領(lǐng)域研究的基礎(chǔ)工作。自然環(huán)境中降解角蛋白的微生物普遍存在，包括真菌、細菌和放線菌等[2～5]。近年來，隨著人們對羽毛類廢棄物資源循環(huán)利用價值認識的深入，越來越多的羽毛分解菌被分離純化培養(yǎng)，從而為羽毛分解機制研究及其開發(fā)利用提供越來越豐富的微生物資源。但未見典型環(huán)境條件下降解羽毛微生物多樣性及優(yōu)勢種群的報道。

本研究從家禽屠宰廠污泥池典型環(huán)境取樣，篩選分離具有羽毛降解能力的微生物菌株，通過16S rDNA的BLAST比對及系統(tǒng)發(fā)育樹進行微生物多樣性分析，為研究羽毛降解機理和微生物資源開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1樣品及菌株分離

樣品采集于山東六和平度屠宰廠污泥沉淀池。取5 g污泥樣品，加到裝有95 ml滅菌水和玻璃珠的三角瓶中，180 r/min振蕩30 min，做成懸液；將上清液梯度稀釋，100 μl涂布牛奶平板，30℃ 倒置培養(yǎng)36 h；挑取水解圈比較大的菌落點接牛奶固體平板；挑取牛奶平板上水解圈較大的菌落接種到含有羽毛粉液體培養(yǎng)基的三角瓶中，180 r/min、30℃搖床培養(yǎng)，篩選能降解羽毛粉的菌株。將具有分解羽毛粉能力的菌株接種到含有完整羽毛的三角瓶中（培養(yǎng)條件同上）進一步篩選，觀察羽毛降解情況。牛奶瓊脂培養(yǎng)基和羽毛粉液體培養(yǎng)基的配制參見黃亦鈞等（2009）[6]的方法。

1.2菌株、質(zhì)粒和材料

細菌和質(zhì)粒見表1。E. coli菌株于LB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)。安芐青霉素終濃度為100 μg/ml。T-載體、Taq酶和T4 DNA連接酶均購自大連TaKaRa公司；DNA Marker、Pfu酶和DNA回收試劑盒均購自北京全式金公司。

3結(jié)論與討論

本研究從家禽屠宰廠污泥沉淀池這一典型環(huán)境中分離到174株產(chǎn)蛋白酶的菌株，利用羽毛培養(yǎng)進一步篩選，得到42株具有羽毛分解能力的菌株，說明了特定環(huán)境下功能微生物的聚落（cluster）特點。對其中分解羽毛能力強的13株菌進行16S rDNA序列分析，BLAST比對結(jié)果表明，8株（61.5%）屬于寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas），4株屬于氣單胞菌屬（Aeromonas），1株屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），說明該環(huán)境中分解羽毛的微生物存在一定程度的多樣性及優(yōu)勢種群。

系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，SDK02、SDK03、SDK04、SDK05、SDK06、SDK07、SDK08、SDK09與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌親緣關(guān)系最近。嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌屬于革蘭氏陰性原核微生物，是一類條件致病菌[10]，已有關(guān)于該菌具有分解羽毛能力及角蛋白酶基因克隆的報道[11，12]；而且S. maltophilia 能分解有毒化合物和高分子的多環(huán)芳香烴[13，14]，也是潛在的生物殺蟲劑和環(huán)境修復(fù)微生物資源。菌株SDK12與枯草芽孢桿菌親緣關(guān)系最近，可歸為枯草芽孢桿菌?？莶菅挎邨U菌屬于應(yīng)用廣泛的益生菌，其降解羽毛的機理和發(fā)酵代謝均有報道[1，15，16]。菌株SDK01、SDK10、SDK11、SDK13為殺鮭氣單胞菌，目前尚未見該類菌具有降解羽毛功能的研究報道，是一類新的有待研究與開發(fā)的微生物資源。

致謝：黃亦鈞博士、許麗紅碩士為本研究做了部分實驗工作，在此表示感謝。

參考文獻：

[1]Cedrola S M L， Melo C A N， Mazotto A M， et al. Keratinases and sulfide from Bacillus subtilis SLC to recycle feather waste [J]. World J. Microbiol. Biotechnol.， 2012， 28：1259-1269.

[2]Muhsin T M， Hadi R B. Degradation of keratin substrates by fungi isolated from sewage sludge[J]. Mycopathologia，2002， 154（4）： 185-189.

[3]Ignatova Z， Gousterova A， Spassov G， et al. Isolation and partial characterization of extracellular keratinase from a wool degraging thermophilic actimomycete strain Thermoatinomyces candidus[J]. Canadian Journal of Microbiology，1999， 45 （3）： 217-222.endprint

[4]Chitte R R， Nalawade V K， Dey S. Keratinolytic activity from the broth of a feather degrading thermophilic Streptomyces thermoviolaceus strain SD-8[J]. Letters in Applied Microbiology，1999， 28（2）：131-136.

[5]Riffel A， Brandelli A. Characterization of a new keratinolytic bacterium that completely degrades native feather keratin[J]. Archives of Microbiology，2003，179（4）：258-265.

[6]黃亦鈞， 尤升波， 游銀偉， 等. 利用高效轉(zhuǎn)座質(zhì)粒構(gòu)建羽毛分解菌Stenotrophomonas maltophilia YHJ-1的突變體庫[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2009，17（5）：931-936.

[7]Allpress J D， Mountain G，Gowland P C. Production， purification and characterization of an extracellular keratinase from Lysobacter NCIMB 9497[J]. Letters in Applied Microbiology， 2002， 34（5）：337-342.

[8]Sambrook J， Fritsch F， Maniatis T. Molecular cloning： A laboratory manual （2nd Edn.） [M]. New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.

[9]Lin X， Lee C G， Casale E S， et al. Purification and characterization of a keratinase from a feather-degrading Bacillus licheniformis strain[J]. Appl. Environ. Microbiol.， 1992， 58（10）： 3271-3275.

[10]Windhorst S， Frank E， Georgieva D N， et al. The major extracellular protease of the nosocomial pathogen Stenotrophomonas maltophilia： characterization of the protein and molecular cloning of the gene[J]. J. Biol. Chem.， 2002， 277 （13）： 11042-11049.

[11]Cao Z J， Zhang Q， Wei D K， et al. Characterization of a novel Stenotrophomonas isolate with high keratinase activity and purification of the enzyme[J]. J. Ind. Microbiol. Biotechnol.，2009，36（2）：181-188.

[12]鄒曉鳳，岳壽松，宋愛榮，等.嗜麥芽窄食單胞菌角蛋白酶基因（KerF）的克隆及其在大腸桿菌中的表達[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2011，19（2）：363-368.

[13]Binks P R， Nicklin S，Bruce N C. Degradation of RDX by Stenotrophomonas maltophilia PB1[J]. Applied and Environmental Microbiology，1995，61（4）：1318-1322.

[14]Juhasz A L， Stanley G A， Britz M L. Microbial degradation and detoxification of high molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons by Stenotrophomonas maltophilia strain VUN 10003[J]. Letters in Applied Microbiology，2000，30（5）：396-401.

[15]游銀偉，尤升波，岳壽松. 產(chǎn)角蛋白酶芽孢菌YYW-1的鑒定及產(chǎn)酶性質(zhì)分析[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2007， 15（3）：543-544.

[16]Cai C G， Chen J S， Qi J J. Purification and characterization of keratinase from a new Bacillus subtilis strain[J]. J. Zhejiang Univ. Sci. B， 2008， 9（9）：713-720.

[17]岳壽松，尤升波，游銀偉，等. 溫度和碳源對分解羽毛的枯草芽孢桿菌YYW-1生長特性的影響[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，2：61-64.山 東 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué)2014，46（2）：85～88Shandong Agricultural Sciencesendprint

[4]Chitte R R， Nalawade V K， Dey S. Keratinolytic activity from the broth of a feather degrading thermophilic Streptomyces thermoviolaceus strain SD-8[J]. Letters in Applied Microbiology，1999， 28（2）：131-136.

[5]Riffel A， Brandelli A. Characterization of a new keratinolytic bacterium that completely degrades native feather keratin[J]. Archives of Microbiology，2003，179（4）：258-265.

[6]黃亦鈞， 尤升波， 游銀偉， 等. 利用高效轉(zhuǎn)座質(zhì)粒構(gòu)建羽毛分解菌Stenotrophomonas maltophilia YHJ-1的突變體庫[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2009，17（5）：931-936.

[7]Allpress J D， Mountain G，Gowland P C. Production， purification and characterization of an extracellular keratinase from Lysobacter NCIMB 9497[J]. Letters in Applied Microbiology， 2002， 34（5）：337-342.

[8]Sambrook J， Fritsch F， Maniatis T. Molecular cloning： A laboratory manual （2nd Edn.） [M]. New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.

[9]Lin X， Lee C G， Casale E S， et al. Purification and characterization of a keratinase from a feather-degrading Bacillus licheniformis strain[J]. Appl. Environ. Microbiol.， 1992， 58（10）： 3271-3275.

[10]Windhorst S， Frank E， Georgieva D N， et al. The major extracellular protease of the nosocomial pathogen Stenotrophomonas maltophilia： characterization of the protein and molecular cloning of the gene[J]. J. Biol. Chem.， 2002， 277 （13）： 11042-11049.

[11]Cao Z J， Zhang Q， Wei D K， et al. Characterization of a novel Stenotrophomonas isolate with high keratinase activity and purification of the enzyme[J]. J. Ind. Microbiol. Biotechnol.，2009，36（2）：181-188.

[12]鄒曉鳳，岳壽松，宋愛榮，等.嗜麥芽窄食單胞菌角蛋白酶基因（KerF）的克隆及其在大腸桿菌中的表達[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2011，19（2）：363-368.

[13]Binks P R， Nicklin S，Bruce N C. Degradation of RDX by Stenotrophomonas maltophilia PB1[J]. Applied and Environmental Microbiology，1995，61（4）：1318-1322.

[14]Juhasz A L， Stanley G A， Britz M L. Microbial degradation and detoxification of high molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons by Stenotrophomonas maltophilia strain VUN 10003[J]. Letters in Applied Microbiology，2000，30（5）：396-401.

[15]游銀偉，尤升波，岳壽松. 產(chǎn)角蛋白酶芽孢菌YYW-1的鑒定及產(chǎn)酶性質(zhì)分析[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2007， 15（3）：543-544.

[16]Cai C G， Chen J S， Qi J J. Purification and characterization of keratinase from a new Bacillus subtilis strain[J]. J. Zhejiang Univ. Sci. B， 2008， 9（9）：713-720.

[17]岳壽松，尤升波，游銀偉，等. 溫度和碳源對分解羽毛的枯草芽孢桿菌YYW-1生長特性的影響[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，2：61-64.山 東 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué)2014，46（2）：85～88Shandong Agricultural Sciencesendprint

[4]Chitte R R， Nalawade V K， Dey S. Keratinolytic activity from the broth of a feather degrading thermophilic Streptomyces thermoviolaceus strain SD-8[J]. Letters in Applied Microbiology，1999， 28（2）：131-136.

[5]Riffel A， Brandelli A. Characterization of a new keratinolytic bacterium that completely degrades native feather keratin[J]. Archives of Microbiology，2003，179（4）：258-265.

[6]黃亦鈞， 尤升波， 游銀偉， 等. 利用高效轉(zhuǎn)座質(zhì)粒構(gòu)建羽毛分解菌Stenotrophomonas maltophilia YHJ-1的突變體庫[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2009，17（5）：931-936.

[7]Allpress J D， Mountain G，Gowland P C. Production， purification and characterization of an extracellular keratinase from Lysobacter NCIMB 9497[J]. Letters in Applied Microbiology， 2002， 34（5）：337-342.

[8]Sambrook J， Fritsch F， Maniatis T. Molecular cloning： A laboratory manual （2nd Edn.） [M]. New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.

[9]Lin X， Lee C G， Casale E S， et al. Purification and characterization of a keratinase from a feather-degrading Bacillus licheniformis strain[J]. Appl. Environ. Microbiol.， 1992， 58（10）： 3271-3275.

[10]Windhorst S， Frank E， Georgieva D N， et al. The major extracellular protease of the nosocomial pathogen Stenotrophomonas maltophilia： characterization of the protein and molecular cloning of the gene[J]. J. Biol. Chem.， 2002， 277 （13）： 11042-11049.

[11]Cao Z J， Zhang Q， Wei D K， et al. Characterization of a novel Stenotrophomonas isolate with high keratinase activity and purification of the enzyme[J]. J. Ind. Microbiol. Biotechnol.，2009，36（2）：181-188.

[12]鄒曉鳳，岳壽松，宋愛榮，等.嗜麥芽窄食單胞菌角蛋白酶基因（KerF）的克隆及其在大腸桿菌中的表達[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2011，19（2）：363-368.

[13]Binks P R， Nicklin S，Bruce N C. Degradation of RDX by Stenotrophomonas maltophilia PB1[J]. Applied and Environmental Microbiology，1995，61（4）：1318-1322.

[14]Juhasz A L， Stanley G A， Britz M L. Microbial degradation and detoxification of high molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons by Stenotrophomonas maltophilia strain VUN 10003[J]. Letters in Applied Microbiology，2000，30（5）：396-401.

[15]游銀偉，尤升波，岳壽松. 產(chǎn)角蛋白酶芽孢菌YYW-1的鑒定及產(chǎn)酶性質(zhì)分析[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2007， 15（3）：543-544.

[16]Cai C G， Chen J S， Qi J J. Purification and characterization of keratinase from a new Bacillus subtilis strain[J]. J. Zhejiang Univ. Sci. B， 2008， 9（9）：713-720.

[17]岳壽松，尤升波，游銀偉，等. 溫度和碳源對分解羽毛的枯草芽孢桿菌YYW-1生長特性的影響[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，2：61-64.山 東 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué)2014，46（2）：85～88Shandong Agricultural Sciencesendprint