劉小珍，張漢堯

(1 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點實驗室,北京 100081；2 西南林業(yè)大學 西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點實驗室，云南 昆明 650224)

酵母作為主要的發(fā)酵微生物不僅對葡萄酒質(zhì)量和發(fā)酵過程影響很大，而且對葡萄酒色澤、香氣、感官質(zhì)量及風格的形成有重要貢獻[1]。用不同菌株發(fā)酵生產(chǎn)的葡萄酒，其酒質(zhì)和風味差別很大。所以尋找能夠適應當?shù)仄咸言咸匦?、有利于形成地域葡萄酒風格的新土著酵母菌株及新酵母種已成為研究的焦點[2-6]。目前，ITS序列的差異分析已被廣泛用于酵母種屬水平的鑒定[7-8]。Zhang等[9]在新西蘭8個酒廠中分離了1 279個菌株，這些菌株分屬9個屬27個種，這些菌種的ITS與已發(fā)表的大部分酵母菌ITS序列存在或多或少的差異。Li等[10]對中國葡萄產(chǎn)區(qū)的釀酒酵母進行了ITS分析，發(fā)現(xiàn)共有8個屬的17個酵母種在中國有分布。朱麗霞等[11]則對新疆慕薩萊思地區(qū)的葡萄酒相關酵母進行了多樣性分析，發(fā)現(xiàn)共有7個屬13個種的酵母。王澤舉等[12]通過對酵母菌5.8S核糖體RNA ITS區(qū)域的PCR擴增，以及限制性酶切片段多態(tài)性(RFLP)圖譜分析和26S rDNA D1/D2區(qū)、5.8S-ITS區(qū)的序列分析，將供試菌株鑒定為4個屬4個種。此外，分子指紋圖譜已被廣泛用于群體中個體差異的研究[13]。Schuller等[14]對葡萄園中發(fā)酵相關的釀酒酵母進行了微衛(wèi)星指紋分析。Howell等[15]則對發(fā)酵期間釀酒酵母的遺傳多樣性進行了微衛(wèi)星分析。云南昆明具有典型的氣候特征和獨特的地理條件，是我國早熟葡萄的重要產(chǎn)地之一，蘊含著豐富的酵母菌資源。但目前尚未見有關云南昆明葡萄產(chǎn)區(qū)釀酒酵母資源的相關研究報道。

本研究擬分離云南昆明葡萄產(chǎn)區(qū)的釀酒酵母資源，并運用ITS分析鑒定其種屬，采用微衛(wèi)星分析鑒定不同釀酒酵母菌株，旨在為這些高原酵母資源的進一步利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

葡萄漿果于2012-08采自昆明官渡區(qū)三瓦村(在葡萄園內(nèi)多點采樣，并注意采集植株各個部位的漿果)，取果皮 1.0 g，加入50 mL滅菌的液體SelMed富集培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)2 d。梯度稀釋后涂布于分離純化平板上，28 ℃培養(yǎng)3 d后，結(jié)合菌落顏色和形態(tài)選取多個菌落進行保藏。

1.2 試 劑

所用引物由上海生物工程公司合成；TaqDNA聚合酶、dNTPs、RNase購自上海生物工程公司；pMD18-T Vector、DNA Marker購自大連寶生物工程公司；酵母基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；2×PowerTaqPCR MasterMix為北京百泰克生物技術有限公司產(chǎn)品。其他常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 DNA提取

按照試劑盒說明書進行提取。將菌種采用劃線法接種到新的培養(yǎng)基上，獲得單菌落。接種單菌落酵母到10 mL酵母試管培養(yǎng)基(YPD培養(yǎng)基)中，28 ℃培養(yǎng)18 h；取1.5 mL酵母培養(yǎng)液,12 000 r/min離心1 min收集菌體；加入600 μL山梨醇buffer,5 μL 10 U/μL溶菌酶(Lyticase),30 ℃處理30 min；4 000 r/min離心10 min,向沉淀中加入200 μL緩沖液GA重懸；加入20 μL蛋白酶K混勻,加入4 μL RNase(100 mg/mL),室溫放置5 min；加入220 μL緩沖液GB,顛倒混勻,70 ℃放置10 min；加220 μL 無水乙醇充分顛倒混勻,所得溶液和沉淀都加入吸附柱中,12 000 r/min離心30 s,向吸附管中加入500 μL緩沖液GD,12 000 r/min離心30 s,向吸附柱中加入500 μL漂洗液PW洗2次,最后加入30 μL ddH2O洗脫柱子上的酵母基因組DNA。

1.4 ITS序列的擴增及RFLP分析

使用通用引物進行分析，其中上游引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；下游引物ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反應體系為15 μL：雙鏈總DNA模板1.0 μL，上下游引物各1.0 μL，2×PowerTaqPCR MasterMix 7.5 μL，用雙蒸水補足至15 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35 個循環(huán)；最后72 ℃終延伸7 min，產(chǎn)物于-20 ℃ 保存。PCR產(chǎn)物檢測：取PCR產(chǎn)物5 μL用EB染色，用質(zhì)量濃度為30 g/L的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，用凝膠成像儀照相。

采用2種限制性內(nèi)切酶HaeⅢ 和HinfⅠ對大于700 bp的PCR 擴增產(chǎn)物進行酶切分析，反應體系及反應條件見文獻[9]。

1.5 ITS序列分析

將PCR產(chǎn)物委托中美泰和生物技術(北京)有限公司測序。運用NCBI 網(wǎng)站上的BLAST 比對測序結(jié)果，從GenBank 中查找與目的基因序列同源性最高且已知分類地位的菌種進行分離菌株鑒定。另外，從GenBank中提取所有與目的基因序列相關且已知的標準菌株序列。

1.6 微衛(wèi)星分析

釀酒酵母的微衛(wèi)星指紋圖譜構建參照Zhang等[9]的方法進行，所用引物見表1。

表1 釀酒酵母微衛(wèi)星分析所用的引物及序列

2 結(jié)果與分析

2.1 昆明地區(qū)葡萄表皮酵母菌株的菌落特征

本研究從采集的葡萄槳果表皮中共分離到了207個單克隆菌落。培養(yǎng)觀察顯示，其中以菌落形態(tài)深紅色的平滑菌落居多，為37個；外觀形態(tài)為奶油色且粗糙凸起的最少，僅有5個；外觀形態(tài)為乳白色且平滑凸起的有35個；外觀形態(tài)為奶油色平滑凸起、黃色平滑凸起、灰色平滑凸起的菌落數(shù)分別為31，26和23個；還有較少部分菌落外觀形態(tài)呈黃色干燥凸起、乳白色粗糙凸起和灰白色粗糙凸起，分別為19，17和14個。

2.2 釀酒相關酵母的ITS分析與鑒定

ITS擴增產(chǎn)物在30 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳檢測得到350～800 bp條帶，符合理論預期的ITS區(qū)片段大小，部分擴增結(jié)果見圖1。再進一步對大于700 bp的PCR擴增產(chǎn)物進行RFLP分析，最終篩選得到了23個釀酒酵母單菌落。隨機選取ITS擴增片段大小相同且外觀形態(tài)有一定差異的菌落各3個送中美泰和生物技術(北京)有限公司測序。ITS序列分析結(jié)果表明：實測的ITS長度為318～771 bp，而G+C的含量則為39.9%～48.9%(表2),所有菌落分屬于3個屬5個種，其中梅奇酵母屬(Metschnikowia)有3個種，分別為金佩梅奇酵母(M.chrysoperlae)、美極梅奇酵母(M.pulcherrima)和核果梅奇酵母(M.fructicola)；紅酵母屬(Rhodotorula)有1個種，為膠紅酵母(R.mucilaginosa)；釀酒酵母屬(Saccharomyces)有1個種，為釀酒酵母(S.cerevisiae)。在鑒定出的3個屬中，梅奇酵母屬(Metschnikowia)在昆明地區(qū)葡萄果粒中出現(xiàn)頻率最高，為昆明地區(qū)的優(yōu)勢酵母屬。

2.3 釀酒酵母的SSR分析

SSR分析結(jié)果表明，所分離出來的23個釀酒酵母分屬4個不同的菌株(具有不同的SSR指紋圖譜)，其中菌株KA17的SSR圖譜見圖2。將這些菌株的指紋圖譜與國際釀酒酵母指紋圖譜庫比對后，發(fā)現(xiàn)其中有1個與歐洲商用菌株X5的指紋圖譜完全一致，另外3個菌株的指紋圖譜并未匹配到親緣關系明顯較近的國際菌株，表明在昆明的葡萄植株上棲息著具有自己遺傳特征的釀酒酵母居群。

圖1 云南昆明部分酵母菌落ITS區(qū)PCR擴增電泳圖譜

表2 5種釀酒相關酵母的ITS序列長度和G+C含量

圖2 釀酒酵母菌株KA17的微衛(wèi)星指紋圖譜

3 討 論

目前，傳統(tǒng)多是通過形態(tài)學、生理生化性狀等對釀酒酵母進行分析，然后將試驗結(jié)果與標準系統(tǒng)進行對比得出鑒定結(jié)論。但在菌落形態(tài)研究中發(fā)現(xiàn)，外形相似的菌落，卻可能分屬于不同的屬，如外形雖皆為乳白色、奶酪狀中間突起，但有些是釀酒酵母(如KA04)，有些卻是梅奇酵母(如KA13)；有些外形有一定差異的菌落卻是同一種菌種，如表面光滑、光亮的KA17與邊緣光滑、暗淡的KB38均屬于釀酒酵母。酵母屬菌種顯微形態(tài)主要以單細胞形式存在，顯微觀察結(jié)果表明，各屬間的細胞性狀很接近，屬內(nèi)種間的細胞差異幾乎觀察不到(數(shù)據(jù)未列出)。因此，形態(tài)學觀察無法提供有效的分類學信息。酵母屬各種間生理生化差異有限，而且這些菌種的表型性狀不穩(wěn)定。有研究表明，以生理生化指標為依據(jù)，有時可將同一菌株的冷凍干燥保藏株和多代斜面保藏株鑒定為不同的種[16]。因此，僅將生理生化特征差異作為酵母屬各種間的分類依據(jù)并不可靠，而且該方法也可能將種水平之下菌株之間的差異誤認為是種間差異。

本研究收集了昆明官渡區(qū)三瓦村的葡萄酒相關酵母，對其形態(tài)特征、培養(yǎng)特征等進行了研究，并運用5.8S-ITS擴增片段的RFLP分析及序列分析確定了菌株的種類歸屬。本研究結(jié)果表明，自昆明葡萄槳果果皮中分離鑒定出的所有釀酒相關酵母菌株分屬于梅奇酵母屬、紅酵母屬、釀酒酵母屬等，其中梅奇酵母屬出現(xiàn)頻率最高，為昆明地區(qū)葡萄表皮酵母的優(yōu)勢屬。需要指出的是，本研究是用SelMed富集培養(yǎng)基培養(yǎng)后再分離鑒定的，而富集培養(yǎng)后的分離鑒定不易反映真實的菌落結(jié)構。上述酵母在以往的研究[7-9]中均出現(xiàn)過，且以往關于葡萄園中葡萄酒相關酵母的研究結(jié)果以梅奇酵母屬為優(yōu)勢或常見屬的報道也較多[17-20]。另外，本研究還進一步用微衛(wèi)星指紋圖譜對分離篩選的23個釀酒酵母進行了鑒定，并發(fā)現(xiàn)了1株與歐洲商用菌株X5指紋圖譜完全一致的菌株，但該菌株在昆明地區(qū)并未用于釀酒，而在歐洲得到了廣泛應用，因此推測該菌株很可能是從歐洲的酒廠逃逸到葡萄植株上，而后隨葡萄植株(或接穗)被引進到昆明。值得注意的是，不同研究報道中關于微衛(wèi)星的菌株區(qū)分能力有一定差異[1,13]，這可能與其所用的微衛(wèi)星引物不同有關。傳統(tǒng)的酵母菌分類及鑒定準確率較低，本研究在分子水平上以DNA序列為分類的依據(jù)，大大提高了菌種分類的準確率。

4 結(jié) 論

1)本研究在分子水平上以DNA序列及微衛(wèi)星指紋圖譜為鑒定的依據(jù)，大大提高了菌種鑒定的準確率，并可將鑒定水平提高至種下水平。

2)在昆明的葡萄園中至少棲息了5種酵母，包括釀酒酵母(S.cerevisiae)、膠紅酵母(R.mucilaginosa)，以及梅奇酵母屬的金佩梅奇酵母(M.chrysoperlae)、美極梅奇酵母(M.pulcherrima)和核果梅奇酵母(M.fructicola)等。

3)分離自昆明官渡區(qū)三瓦村的葡萄酒相關酵母部分可能源于歐洲，是隨葡萄植株(或接穗)被引進到昆明的。

[參考文獻]

[1] Romano P,Capece A,Serafino V,et al.Biodiversity of wild strains ofSaccharomycescerevisiaeas tool to complement and optimize wine quality [J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2008,24(9):1797-1802.

[2] Pretorius I S.Tailoring wine yeasts for the new millenium:Novel approaches to the ancient art of winemaking [J].Yeast,2000,16(8):675-729.

[3] Caruso M,Fiore C,Contursi M,et al.Formation of biogenic amines as criteria for the selection of wine yeasts [J].World Journal of Microbiology & Biotechnology,2002,18(2):159-163.

[4] Cocolin L,Manzano M,Rebecca S,et al.Monitoring of yeast population changes during a continuous wine fermentation by molecular methods [J].American Journal of Enology and Viticulture,2002,53(1):24-27.

[5] Espinosa J C,Fernandez-Gonzalez M,Ubeda J,et al.Identification of wine yeasts by PCR-RFLP without previous isolation on plate [J].Food Technology and Biotechnology,2002,40(2):157-160.

[6] Martinez C,Cosgaya P,Vásquez C,et al.High degree of correlation between molecular polymorphism and geographic origin of wine yeast strains [J].Journal of Applied Microbiology,2007,103(6):2185-2195.

[7] Esteve-Zarzoso B,Belloch C,Uruburu F,et al.Identification of yeasts by RFLP analysis of the 5.8S rRNA gene and the two ribosomal internal transcribed spacers [J].International Journal of Systematic Bacteriology,1999,49(1):329-337.

[8] Dlauchy D,Tornai-Lehoczki J,Peter G.Restriction enzyme analysis of PCR amplifed rDNA as a taxonomic tool in yeast identification [J].Systematic and Applied Microbiology,1999,22(3):445-453.

[9] Zhang H Y，Lee S A,Bradbury J,et al.Yeasts isolated from New Zealand vineyards and wineries [J].Australian Journal of Grape and Wine Research,2010,16(3):491-496.

[10] Li S S,Cheng C,Li Z,et al.Yeast species associated with wine grapes in China [J].International Journal of Food Microbiology,2010,138(1/2):85-90.

[11] 朱麗霞，李紅梅，郭東起，等.新疆慕薩萊思自然發(fā)酵過程中酵母菌表型多樣性及優(yōu)勢菌分析 [J].食品科學，2012,33(7):142-147.

Zhu L X,Li H M,Guo D Q,et al.Phenotype diversity and dominant species of yeasts during spontaneous fermentation process of Musalais from Xinjiang [J].Food Science,2012,33(7):142-147.(in Chinese)

[12] 王澤舉，王汝瑱，孫 悅，等.幾株酵母菌的分子系統(tǒng)學鑒定 [J].食品科學，2012，33(15):195-200.

Wang Z J，Wang R Z，Sun Y，et al.Molecular phylogenic identification of wine-related yeasts [J].Food Science,2012，33(15):195-200.(in Chinese)

[13] Bradbury J E,Richards K D,Niederer H A,et al.A homozygous diploid subset of commercial wine yeast strains [J].Antonie van Leeuwenhoek,2005,89(1):27-37.

[14] Schuller D,Casal M.The genetic structure of fermentative vi-neyard-associatedSaccharomycescerevisiaepopulations revealed by microsatellite analysis [J].Antonie van Leeuwenhoek,2007,91(2):137-150.

[15] Howell K S,Bartowsky E J,Fleet G H,et al.Microsatellite PCR profiling ofSaccharomycescerevisiaestrains during wine fermentation [J].Letters in Applied Microbiology,2004,38(4):315-320.

[16] 白逢彥，賈建華，梁慧燕.假絲酵母屬疑難菌株大亞基rDNA D1/D2區(qū)域序列分析及其分類學意義 [J].菌物系統(tǒng)，2002,21(1):27-32.

Bai F Y,Jia J H,Liang H Y.Molecular taxonomic study on the problematicCandidastrains based on 26S rDNA D1/D2 domain sequence comparison [J].Mycosystema,2002,21(1):27-32.(in Chinese)

[17] Nurgel C,Erten H,Canbas A,et al.Yeast flora during the fermentation of wines made fromVitisviniferaL.cv.Emir andKalecikkarasigrown in Anatolia [J].World Journal of Microbiology & Biotechnology,2005,21(6/7):1187-1194.

[18] Sipiczki M.Metschnikowiastrains isolated from botrytized gr-apes antagonize fungal and bacterial growth by iron depletion [J].Applied and Environmental Microbiology,2006,72(10):6716-6724.

[19] Lopandic K,Tiefenbrunner W,Gangl H,et al.Molecular profiling of yeasts isolated during spontaneous fermentations of Austrian wines [J].FEMS Yeast Res,2008,8(7):1063-1075.

[20] Comitini F,Ciani M.Influence of fungicide treatments on the occurrence of yeast flora associated with wine grapes [J].Annals of Microbiology,2008,58(3):489-493.