伍小紅，袁亞宏，岳田利

(1 西北政法大學(xué) 經(jīng)濟管理學(xué)院，陜西 西安 710063；2 西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

展青霉素(Patulin)是青霉屬、曲霉屬、裸囊菌屬和絲衣霉屬中某些真菌的次生代謝產(chǎn)物[1]，具有致畸、致癌和致突變作用[2]。展青霉素在霉?fàn)€的果蔬及其制品中均有發(fā)現(xiàn)，且在蘋果汁、葡萄汁中表現(xiàn)很穩(wěn)定[3]。目前，展青霉素的控制方法主要有物理吸附、輻照處理、微波處理、添加食品添加劑處理、生物處理等方法[4-5]。簡單的物理吸附法對溶液中的展青霉素具有一定的吸附去除作用，活性炭和膨潤土可作為良好的結(jié)合劑來吸附溶液中存在的毒素。有研究證明，使用3～5 g/L活性炭對含有展青霉素的蘋果汁處理5 min，即可有效降低展青霉素的污染水平[6]；Huebner等[7]開展了基于復(fù)合碳-固定床吸附器的蘋果汁中展青霉素的控制研究；Kadakal等[8]研究發(fā)現(xiàn)，使用活性炭可以將蘋果酒中質(zhì)量濃度為30 μg/mL的展青霉素完全去除。但是上述研究也顯示，利用活性碳吸附展青霉素的同時會明顯影響果汁本身的品質(zhì)。在其余控制方法中，輻照處理法局限性較大[9]，微波處理工業(yè)化應(yīng)用難度較大，添加食品添加劑的方法則不適合天然果汁的生產(chǎn)。因此，尋求建立一種高效安全的生物吸附法以實現(xiàn)展青霉素的有效控制是目前國內(nèi)外研究的熱點。

生物吸附是指以酵母、乳酸菌等生物體細胞及其衍生物為吸附劑，實現(xiàn)環(huán)境及樣品中污染物去除與控制的處理方法[10-11]。釀酒酵母是食品工業(yè)中廣泛使用的一種微生物，其失活菌體對果汁中的展青霉素具有良好的吸附效果，這一結(jié)論在之前的研究中已經(jīng)得到了充分的驗證[12-13]。但是由于失活酵母細胞個體微小，在處理展青霉素之后對其進行分離時存在一定困難，這就限制了失活酵母在果汁生產(chǎn)中的實際應(yīng)用。而基于材料學(xué)與生物學(xué)相結(jié)合的酵母固定化技術(shù)可使失活酵母快速分離與聚集，耐毒害能力增強，特別是使其反應(yīng)更加穩(wěn)定，并且減少了微生物的流失，產(chǎn)物更易分離，為基于生物吸附法的展青霉素的有效控制提供了新思路[14-16]。但目前通過固定化技術(shù)改良微生物細胞進行污染物去除的研究，主要集中在水體中重金屬去除控制方面[17-18]。為此，本試驗以固定化失活酵母為吸附劑進行蘋果汁中展青霉素的去除研究，通過對去除工藝條件的系統(tǒng)優(yōu)化，以期為蘋果汁中展青霉素的有效控制提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

釀酒酵母，來源于西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院發(fā)酵動力學(xué)實驗室；濃縮蘋果汁，由陜西恒興果汁飲料有限公司提供；展青霉素標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99%，購買于上海貝基生物科技有限公司。

主要試劑有乙腈(色譜純，純度99.5%以上)、乙酸乙酯(分析純，純度99.5%以上)、乙酸(分析純，純度約98%)、乙醇(分析純，純度99.7%以上)、碳酸鈉(分析純)、海藻酸鈉、無水氯化鈣等。

1.2 主要儀器與設(shè)備

SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；HSQ-3型恒溫水浴鍋，上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；UV-2550型雙光束紫外可見光分光光度計、LC-2010A型高效液相色譜儀，日本島津公司。

1.3 展青霉素貯備液的制備

稱取5.0 mg展青霉素標(biāo)準(zhǔn)品，用乙酸乙酯充分溶解，定容至20.00 mL。將配好的展青霉素貯備液轉(zhuǎn)至棕色磨口試劑瓶中，冷藏備用。

1.4 酵母菌的培養(yǎng)

1.4.1 酵母菌的活化 取保存的菌種于YPD平板培養(yǎng)基上進行劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28 ℃，培養(yǎng)時間為24 h。

1.4.2 一級培養(yǎng) 將經(jīng)過24 h活化的酵母菌接種到80 mL蘋果汁培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)24 h。

1.4.3 二級培養(yǎng) 將一級培養(yǎng)獲得的種子液接種(接種量5%)到100 mL蘋果汁培養(yǎng)基中，于28 ℃、120 r/min條件下擴大培養(yǎng)24 h。

1.5 固定化失活酵母的制備

1.5.1 失活酵母的制備 對擴增獲得的酵母菌培養(yǎng)液離心、洗滌，得到酵母泥。然后在80 ℃條件下對酵母菌滅活處理45 min，得到失活的酵母菌體。

1.5.2 酵母細胞活性的鑒定 為了避免酵母對果汁產(chǎn)生發(fā)酵反應(yīng)并保證完全是失活酵母細胞在果汁中起作用，通過美蘭染色法鑒定滅活處理后酵母細胞的活性。具體操作步驟如下[15]：在載玻片中央加1滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的美蘭染色液，取少許酵母粉放在染液中，混合均勻，用鑷子取一塊蓋玻片，先將一邊與菌液接觸，然后慢慢將蓋玻片放下使其蓋在菌液上，將制品放置約3 min后鏡檢，分別用低倍鏡和高倍鏡觀察酵母的細胞形態(tài)、出芽及染色情況，染色0.5 h后再次觀察，如果細胞無色表示是活細胞，如果細胞不褪色表示其已完全失活[19]。

1.5.3 失活酵母的固定化 采用海藻酸鈉包埋法進行失活酵母的固定化[20]。具體操作步驟如下：稱取1.66 g無水CaCl2，加入300 mL蒸餾水溶解，制備獲得0.05 mol/L CaCl2溶液。同時，將3 g海藻酸鈉加入100 mL蒸餾水中，用電磁爐緩慢加熱并攪拌，將其完全溶化。將溶化好的海藻酸鈉溶液冷卻至室溫，加入30 g酵母泥，充分?jǐn)嚢枋蛊浠旌暇鶆?，形成海藻酸鈉-酵母菌懸液，轉(zhuǎn)移至配有22-G1型號針頭的注射器中。以恒定的速度緩慢將注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中，形成凝膠珠，靜置1 h，使其完全固定化。無菌去離子水洗滌固定化的失活酵母細胞，并重新加入0.05 mol/L CaCl2溶液，4 ℃下平衡備用。本試驗中獲得的凝膠顆粒直徑為1.5～2 mm，經(jīng)過5 000 r/min 離心試驗測試，證明該酵母顆粒機械強度較高，具備穩(wěn)定的物理性能，可滿足試驗的要求。

1.6 試驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理

1.6.1 單因素試驗設(shè)計 (1)固定化失活酵母劑量的影響。精確稱取固定化失活酵母0，0.3，0.5，0.7，0.9 g，分別加入到30 mL加標(biāo)果汁樣品中，使固定化失活酵母的劑量分別為3.3，10.0，16.7，23.3和30.0 g/L，室溫條件下振蕩吸附，振動頻率為120 r/min，吸附時間為24 h，評價固定化失活酵母劑量對展青霉素去除率的影響。(2)吸附時間的影響。分別將0.5 g固定化失活酵母加入到不同加標(biāo)果汁樣品中(30 mL)，于室溫條件下振蕩(120 r/min)吸附，分別在吸附開始的6，12，18，24 h取樣，測定吸附時間對展青霉素去除率的影響。(3)展青霉素初始質(zhì)量濃度的影響。分別取30 mL質(zhì)量濃度分別為50，100，300，500 μg/L的加標(biāo)蘋果汁，加入0.5 g固定化失活酵母于室溫條件下振蕩(120 r/min)吸附，吸附時間為24 h，評價展青霉素初始質(zhì)量濃度對蘋果汁中展青霉素去除率的影響。(4)蘋果汁pH的影響。以pH緩沖液調(diào)節(jié)蘋果汁的pH分別為3.0，4.0，5.0，加入0.5 g固定化失活酵母，于室溫條件下振蕩(120 r/min)吸附，吸附時間為24 h，評價蘋果汁pH對展青霉素去除率的影響。

每次吸附完成后將固定化失活酵母顆粒與果汁分離，采用HPLC法測定果汁中的展青霉素含量，每個處理設(shè)3次重復(fù)。同時，以未添加固定化失活酵母的蘋果汁為空白對照。

1.6.2 Box-Behnken試驗設(shè)計 通過單因素試驗，確定去除展青霉素的最佳固定化失活酵母劑量、吸附時間、展青霉素初始質(zhì)量濃度和蘋果汁pH值，分別以X1、X2、X3、X4表示，并以1、0、-1分別代表自變量的高、中、低3個不同的編碼水平。然后進行Box-Behnken試驗設(shè)計，其因素和水平見表1。

表 1 固定化失活酵母去除蘋果汁中展青霉素工藝的Box-Behnken試驗的因素及水平

1.6.3 去除率計算 各處理樣品中展青霉素去除率的計算公式為：q=(C0-Ci)/C0×100%。式中，q為固定化失活酵母對展青霉素的去除率，%；C0為吸附前樣品中展青霉素的質(zhì)量濃度，μg/L；Ci為吸附后樣品中展青霉素的質(zhì)量濃度，μg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果汁中展青霉素去除率的影響因素

不同因素對蘋果汁中展青霉素去除率的影響見圖1～圖4。

2.1.1 固定化失活酵母劑量 由圖1可知，當(dāng)固定化失活酵母劑量依次為3.3，10.0，16.7，23.3和30.0 g/L時，果汁中展青霉素的質(zhì)量濃度明顯下降，固定化失活酵母對果汁中展青霉素的去除率依次為43.2%，64.8%，68.8%，68.8%，68.8%。由此判斷，劑量為3.3～30.0 g/L的固定化失活酵母對果汁中的展青霉素均有吸附作用，吸附效果取決于酵母劑量大小，但當(dāng)固定化失活酵母劑量為16.7 g/L時，其對果汁中展青霉素的吸附達到最大，繼續(xù)增加其用量不會使展青霉素的去除率進一步升高。由此確定固定化失活酵母的最佳劑量為16.7 g/L。

2.1.2 固定化失活酵母吸附時間 由圖2可知，對展青霉素初始質(zhì)量濃度為96.97 μg/L的蘋果汁樣品，用固定化失活酵母吸附6 h時，展青霉素質(zhì)量濃度下降至78.64 μg/L，去除率為18.9%；吸附12 h后，展青霉素的質(zhì)量濃度下降至39.08 μg/L，去除率為59.7%；當(dāng)吸附時間為18 h時，展青霉素質(zhì)量濃度下降至25.80 μg/L，去除率為73.39%；當(dāng)吸附時間延長至24 h時，展青霉素的質(zhì)量濃度為24.08 μg/L，去除率為75.17%，此時，展青霉素的吸附去除基本達到平衡，繼續(xù)延長吸附時間對展青霉素去除率影響不大。因此綜合考慮，確定固定化失活酵母的最佳吸附時間為18 h。

圖 1 固定化失活酵母劑量對蘋果汁中展青霉素去除率的影響

2.1.3 蘋果汁中展青霉素初始質(zhì)量濃度 如圖3所示，按照30 mL樣品中加入0.5 g固定化失活酵母，對展青霉素初始質(zhì)量濃度為50 μg/L的蘋果汁加標(biāo)樣品進行24 h吸附處理，展青霉素去除率達到79.12%；隨著加標(biāo)果汁樣品中展青霉素初始質(zhì)量濃度的增大，固定化失活酵母對展青霉素的去除率呈下降趨勢，當(dāng)展青霉素初始質(zhì)量濃度為500 μg/L時，其去除率為27.38%。

圖 3 蘋果汁中展青霉素初始質(zhì)量濃度對固定化失活酵母去除展青霉素的影響

由此得出，展青霉素初始質(zhì)量濃度為50～500 μg/L時，固定化失活酵母對其均有去除作用，但是去除效果隨著展青霉素初始質(zhì)量濃度的不同而變化較大。隨著加標(biāo)樣品中展青霉素初始質(zhì)量濃度的升高，固定化失活酵母對展青霉素的吸附去除率呈現(xiàn)下降趨勢，并最終達到吸附平衡。這是因為對于一定量的固定化酵母，其可以吸附展青霉素的結(jié)合位點總量是一定的，當(dāng)展青霉素質(zhì)量濃度逐漸增大時，固定化失活酵母吸附到的目標(biāo)物增多，當(dāng)展青霉素初始質(zhì)量濃度增大到一定程度時，固定化失活酵母的吸附位點基本被完全結(jié)合，即使繼續(xù)增大加標(biāo)果汁中展青霉素的質(zhì)量濃度，固定化酵母細胞對其的吸附總量也不會有太大改變。因此，本試驗確定的展青霉素的最佳初始質(zhì)量濃度為100 μg/L，在此條件下展青霉素去除率可以達到75.16%。

2.1.4 蘋果汁pH值 由圖4可知，在展青霉素初始質(zhì)量濃度為96.97 μg/L的加標(biāo)樣品中，當(dāng)蘋果汁pH值為3.0，4.0和5.0時，去除率分別為46.1%，73.7%和80.8%。可見，展青霉素的去除率隨著pH的增大而增加。據(jù)文獻報道[16]，展青霉素在酸性條件下比較穩(wěn)定，不易分解，所以蘋果汁本身的酸度對固定化失活酵母去除展青霉素起著至關(guān)重要的影響。固定化失活酵母可以用于不同酸度蘋果汁樣品中展青霉素的吸附去除，在蘋果汁pH值為5.0時具有最佳的效果。

2.2 蘋果汁中展青霉素去除工藝條件的優(yōu)化

2.2.1 Box-Behnken試驗 在單因素試驗基礎(chǔ)上，進行4因素3水平的Box-Behnken試驗設(shè)計，對蘋果汁中展青霉素去除工藝進行優(yōu)化，結(jié)果見表2。

表 2 固定化失活酵母去除蘋果汁中展青霉素工藝的Box-Behnken試驗結(jié)果

利用Desingn-Expert 7.0軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到的二次多項回歸模型方程為：

表 3 蘋果汁中展青霉素去除率與其影響因素回歸模型的方差分析結(jié)果

2.2.2 各因素交互作用對展青霉素去除的影響 固定2個因素水平，分別考察其余2個因素對展青霉素去除率的影響，得到展青霉素初始質(zhì)量濃度(X1)和蘋果汁pH值(X2)、吸附時間(X4)和固定化失活酵母劑量(X3)對展青霉素去除率(Y)的影響如下式所示：

圖5和圖6分別為固定化失活酵母吸附去除蘋果汁中展青霉素的過程中，展青霉素初始質(zhì)量濃度與蘋果汁pH值、吸附時間與固定化失活酵母劑量之間交互作用對展青霉素去除率影響的響應(yīng)面曲線。由圖5可知，當(dāng)固定化失活酵母劑量為16.7 g/L、吸附時間為18 h時，等高曲線沿X2(蘋果汁pH值)方向變化較快，呈拋物線形式變化，而沿X1(展青霉素初始質(zhì)量濃度)方向變化較慢，表明在本試驗水平下，蘋果汁pH值對去除率的影響較展青霉素初始質(zhì)量濃度明顯。由圖6可知，當(dāng)蘋果汁pH值和展青霉素初始質(zhì)量濃度分別為4.0和100.0 μg/L時，等高曲線沿X4(吸附時間)方向變化較快，呈拋物線形式變化，而沿X3(固定化失活酵母劑量)方向變化較慢，提示在試驗水平下，吸附時間對去除率的影響較固定化失活酵母劑量明顯。

2.2.3 展青霉素的最佳去除工藝 利用SAS 9.1軟件分析得到固定化失活酵母去除蘋果汁中展青霉素的最佳工藝條件為：展青霉素初始質(zhì)量濃度 90.52 μg/L，蘋果汁pH=4.46，固定化失活酵母劑量15.13 g/L，吸附時間18.16 h，在此條件下，固定化失活酵母對蘋果汁中展青霉素的去除率為72.89%。對上述優(yōu)化條件進行試驗驗證，可知展青霉素的去除率為71.36%。

圖 5 展青霉素初始質(zhì)量濃度、蘋果汁pH及其交互作用對固定化失活酵母去除蘋果汁中展青霉素的影響

3 結(jié) 論

1)以單因素試驗為基礎(chǔ)，利用響應(yīng)曲面法對影響固定化失活酵母去除蘋果汁中展青霉素的關(guān)鍵因子及其交互作用進行分析，結(jié)果表明，各因素對展青霉素去除率的影響由小到大順序為展青霉素初始質(zhì)量濃度<固定化失活酵母劑量<吸附時間<蘋果汁pH值。優(yōu)化獲得的固定化失活酵母去除蘋果汁中展青霉素的最佳工藝條件為：展青霉素初始質(zhì)量濃度90.52 μg/L，蘋果汁pH=4.46，固定化失活酵母劑量15.13 g/L，吸附時間18.16 h。在此條件下，展青霉素的去除率為71.36%。

2)與傳統(tǒng)展青霉素去除方法相比，采用固定化失活酵母去除蘋果汁中展青霉素時，該方法具有高效快捷、成本低廉的特點，且極大提高了蘋果汁的安全性，因此該方法具有很強的實用價值，其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景極為廣闊。

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