富硒地區(qū)山羊組織中的硒沉積量及其對(duì)PHGPx表達(dá)的影響

張 磊，周占琴，付明哲，李 廣，李思瑤

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，廣東 廣州 510642)

硒是一種維持動(dòng)物正常生長(zhǎng)發(fā)育不可或缺的營(yíng)養(yǎng)元素，其在土壤-牧草-飼料-動(dòng)物鏈(Soil-Pasture-Feed-Animal Chain，SPFAC)中進(jìn)行傳導(dǎo)[1]，即動(dòng)物體內(nèi)的硒元素主要來自攝入的植物中的硒，而植物中的硒元素最終又來源于土壤[2]。但是我國(guó)大部分地區(qū)處于不同程度的缺硒狀態(tài)，約有30%以上地區(qū)缺硒較為嚴(yán)重[3]，陜西紫陽(yáng)縣是我國(guó)僅有的兩處富硒地區(qū)之一。Ursini等[4]于1982年首次分離純化得到磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶(Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase,PHGPx)，直到1985年才有學(xué)者證實(shí)其含有硒元素。PHGPx是谷胱甘肽過氧化酶家族重要的含硒酶成員之一，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)廣泛分布[5]，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中惟一能直接還原生物膜上磷脂氫過氧化物的抗氧化酶[6]。PHGPx一方面參與細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡的調(diào)控，保護(hù)生物膜系統(tǒng)免受氧化損傷[7-8]，另一方面還參與呼吸鏈的氧化應(yīng)激從而調(diào)控細(xì)胞凋亡[9]。有研究表明，缺硒會(huì)影響PHGPx基因的翻譯以及PHGPx蛋白正常生物學(xué)功能的發(fā)揮[10-11]，而且PHGPx基因的表達(dá)受到多種因素的調(diào)節(jié)，如動(dòng)物日糧微量元素水平、日糧蛋白水平、性別、種屬和組織差異性等[12-15]。

土壤中的硒含量與植物的硒含量存在明顯的正相關(guān)關(guān)系[16-17]，但是與動(dòng)物體內(nèi)硒沉積量的關(guān)系目前尚未見報(bào)道。另外，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)PHGPx的研究都聚焦于其在發(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá)和補(bǔ)硒對(duì)其影響方面[18-20]，且有關(guān)硒元素調(diào)控PHGPx基因表達(dá)的研究結(jié)果也不盡一致，而關(guān)于生活在自然富硒地區(qū)山羊組織中硒含量及其對(duì)PHGPx基因在mRNA水平上表達(dá)的影響尚未見報(bào)道。鑒于此，研究紫陽(yáng)地區(qū)山羊不同組織器官中硒含量的差異及對(duì)PHGPx基因表達(dá)的影響，對(duì)進(jìn)一步探討微量元素硒在山羊體內(nèi)的沉積情況及其對(duì)PHGPx基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制具有重要的意義，同時(shí)希望本試驗(yàn)結(jié)果能夠?yàn)槌浞趾侠砝米详?yáng)縣的富硒資源提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(離心柱型DP431)，購(gòu)自天根生化科技有限公司；焦碳酸二乙酯(DEPC)，購(gòu)自Sigma公司；Marker、Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒、SYBR Premix ExTaqTM(RR820A)，均購(gòu)自TaKaRa公司。熒光定量PCR 8連管(B72711)，購(gòu)自BIO-plastics公司；CFX96熒光定量PCR儀，購(gòu)自BIO-RAD公司。

1.2 樣品的準(zhǔn)備

分別在陜西紫陽(yáng)縣雙安鎮(zhèn)(試驗(yàn)Ⅰ組)、高灘鎮(zhèn)(試驗(yàn)Ⅱ組)以及寶雞市陳倉(cāng)區(qū)(對(duì)照組)各購(gòu)買7只體質(zhì)量為45 kg左右的1周歲公山羊，作為試驗(yàn)材料。山羊采取血液后分離血清，然后采用切斷頸動(dòng)脈放血法屠宰，立即采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、背最長(zhǎng)肌、股二頭肌以及羊毛組織樣，每個(gè)組織至少采集6份生物學(xué)重復(fù)樣，一半用樣袋裝好，標(biāo)記后帶回實(shí)驗(yàn)室，放入-20 ℃冰箱保存，用于組織硒含量測(cè)定；另一半用錫箔紙包好標(biāo)記后立即投入液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室，放入-80 ℃冰箱保存，用于mRNA的定量分析。

1.3 血清和組織器官中硒含量的測(cè)定及相關(guān)性分析

參照GB/T 13883-2008的方法處理樣品，分別用超純水和硒標(biāo)準(zhǔn)液做空白對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)參照物對(duì)照，采用氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法[10]測(cè)定心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、背最長(zhǎng)肌、股二頭肌、羊毛和血清樣品中的硒含量，然后對(duì)血清硒含量與其他組織中的硒含量進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

1.4.1 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 使用總RNA提取試劑盒提取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、背最長(zhǎng)肌、股二頭肌組織樣品總RNA。采用紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)總RNA濃度。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳和OD260/OD280的值檢測(cè)RNA的質(zhì)量，總RNA于-80 ℃冰箱保存、備用。然后以提取的RNA作為反轉(zhuǎn)錄模板，采用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒合成 cDNA，cDNA于-20 ℃保存、備用。

1.4.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 參照GenBank中PHGPx基因(GenBank登錄號(hào)：NM_174770.3)[21]和內(nèi)參甘油-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因(GenBank登錄號(hào)：AF030943)的mRNA序列，利用NCBI Blast 和Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR跨內(nèi)含子引物(表1)，引物交由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.4.3 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將各組織cDNA進(jìn)行2倍稀釋(分別為20,2-1,2-2,2-3,2-4,2-5,2-6倍)，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，軟件自動(dòng)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴(kuò)增曲線、溶解曲線和循環(huán)閾值。

表1 引物序列信息

1.4.4 qRT-PCR反應(yīng)PHGPx基因的表達(dá)分析采用SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，反應(yīng)體系為20 μL：2 μL (100 ng) cDNA，10 μL SYBR Premix ExTaqⅡ(2×)，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，滅菌去離子水6.4 μL。每個(gè)樣品均重復(fù)3次。參照SYBR Premix ExTaqTM (RR820A)說明書,PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性45 s；95 ℃變性10 s，64 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)；并設(shè)置相應(yīng)的空白對(duì)照，PCR結(jié)束之后采用溶解曲線來判定引物的特異性。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 各組織器官中硒含量的測(cè)定結(jié)果

由表2可知，山羊心臟、肝臟、脾臟、羊毛以及血清中硒含量在試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組和對(duì)照組間依次降低，且兩兩組間差異極顯著(P<0.01)。試驗(yàn)Ⅰ組山羊肺臟中硒含量為0.336 5 μg/g，極顯著高于試驗(yàn)Ⅱ組(0.128 9 μg/g)和對(duì)照組(0.103 6 μg/g)(P<0.01)，而試驗(yàn)Ⅱ組和對(duì)照組間差異不顯著(P>0.05)。3組山羊均以腎臟硒含量最高，試驗(yàn)Ⅰ組、Ⅱ組和對(duì)照組分別達(dá)到 0.715 9，0.502 3和0.325 6 μg/g，試驗(yàn)Ⅰ組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，試驗(yàn)Ⅱ組與其他2組差異均不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)Ⅰ組背最長(zhǎng)肌和股二頭肌中的硒含量均極顯著高于試驗(yàn)Ⅱ組和對(duì)照組(P<0.01)，背最長(zhǎng)肌中硒含量分別是試驗(yàn)Ⅱ組、對(duì)照組的3.11倍和4.15倍，股二頭肌中分別為3.13倍和5.28倍；試驗(yàn)Ⅱ組背最長(zhǎng)肌和股二頭肌中硒含量分別是對(duì)照組的1.34倍和1.69倍(P<0.05)。

對(duì)血清硒含量與其他組織中硒含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果(表2)表明，山羊血清中硒含量與其他組織中的硒含量呈正相關(guān)關(guān)系。雖然相關(guān)系數(shù)差異均未達(dá)到顯著水平，但是血清硒含量與心臟、肝臟和脾臟硒含量的相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到0.806，0.778和0.864。

表2 山羊各組織中的硒含量及其與血清中硒含量的相關(guān)性

2.2 山羊總RNA的完整性檢驗(yàn)

從山羊各組織器官中提取的總RNA經(jīng)10 g/L變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，出現(xiàn)2條清晰的條帶(圖1)，表明RNA完整。經(jīng)核酸定量?jī)x檢測(cè)OD260/OD280的值在1.8～2.1，純度符合實(shí)時(shí)熒光定量PCR要求，可以進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

圖1 山羊總RNA樣品的電泳檢測(cè)(部分結(jié)果)

2.3 山羊組織中PHGPx基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量

由表3可以看出，試驗(yàn)Ⅰ組山羊PHGPx基因mRNA的表達(dá)量由高到低依次為肺臟>股二頭肌>脾臟>腎臟>心臟>背最長(zhǎng)肌>肝臟。試驗(yàn)Ⅱ組山羊的順序?yàn)榉闻K>股二頭肌>脾臟>肝臟>腎臟>心臟>背最長(zhǎng)肌。對(duì)照組山羊的順序?yàn)槠⑴K>股二頭肌>背最長(zhǎng)肌>肝臟>肺臟>心臟>腎臟，組織間差異不顯著(P>0.05)。

由表3還可以看出，試驗(yàn)Ⅰ組和Ⅱ組間心臟組織PHGPx基因mRNA的表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)，但均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；Ⅱ組山羊肝臟中PHGPx基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于Ⅰ組和對(duì)照組(P<0.05)，Ⅰ組與對(duì)照組差異不顯著；3組山羊脾臟、腎臟、背最長(zhǎng)肌和股二頭肌中PHGPx基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)；Ⅰ和Ⅱ組山羊肺臟PHGPx基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，Ⅰ組與Ⅱ組之間差異不顯著。

3 討 論

3.1 山羊組織器官中的硒含量

硒的分布具有明顯的區(qū)域性，其含量與自然地理?xiàng)l件及土壤類型有關(guān)系。陜西省紫陽(yáng)縣是我國(guó)繼湖北恩施地區(qū)之后發(fā)現(xiàn)的第二處高硒地區(qū)。整個(gè)紫陽(yáng)地區(qū)土壤含硒量都比較豐富，但是從西南到東北依次降低，其中雙安鎮(zhèn)土壤含硒量最高，達(dá)到23.63 mg/kg[22]。本試驗(yàn)通過氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法測(cè)定雙安鎮(zhèn)、高灘鎮(zhèn)和寶雞市陳倉(cāng)區(qū)山羊各組織器官中的硒沉積量，結(jié)果顯示，山羊體內(nèi)硒含量從高到低依次為紫陽(yáng)縣雙安鎮(zhèn)>紫陽(yáng)縣高灘鎮(zhèn)>寶雞市陳倉(cāng)區(qū)，這表明山羊體內(nèi)的硒沉積量受到當(dāng)?shù)赝寥篮康挠绊憽?/p>

表3 山羊不同組織中PHGPx基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量

微量元素硒沉積于機(jī)體的所有組織器官中，其分布情況因組織器官和攝入量而異[19]。一般說來，動(dòng)物腎臟和肝臟中含硒量較高，肌肉(心肌硒含量高于骨骼肌)相對(duì)較低，脂肪組織最低。Fukuhara等[18]研究表明，在日糧中硒含量保持正常的條件下，機(jī)體組織中硒含量分布按腎臟、肝臟、脾臟、心臟、肌肉、脂肪順序依次遞減，與本試驗(yàn)的結(jié)果相似。值得指出的是，動(dòng)物肝臟和腎臟中硒含量對(duì)日糧中硒含量的變動(dòng)十分敏感，而且肝臟和腎臟有貯存過量硒的能力[20]，當(dāng)體內(nèi)缺乏硒時(shí)，肝臟中貯存的硒元素便會(huì)向全身輸送以保證其他組織硒的供應(yīng)。另外本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，紫陽(yáng)雙安鎮(zhèn)(試驗(yàn)Ⅰ組)山羊背最長(zhǎng)肌中硒含量分別是紫陽(yáng)高灘鎮(zhèn)(試驗(yàn)Ⅱ組)和寶雞陳倉(cāng)區(qū)(對(duì)照組)的3.11倍和4.15倍，股二頭肌分別為3.13倍和5.28倍，而且紫陽(yáng)高灘鎮(zhèn)山羊背最長(zhǎng)肌和股二頭肌中的硒含量分別是寶雞陳倉(cāng)區(qū)的1.34倍和1.69倍，表明紫陽(yáng)縣的山羊肉中富含微量元素硒，這將為紫陽(yáng)縣發(fā)展富硒羊肉的生產(chǎn)提供科學(xué)的數(shù)據(jù)支持。

本研究還發(fā)現(xiàn)，山羊血清中硒含量與其他組織中的硒含量呈正相關(guān)關(guān)系。這提示我們?cè)谛竽辽a(chǎn)上，可以在不屠宰羊只的情況下，通過采集、檢測(cè)血清中的硒含量，推斷其他組織中的硒含量。這樣不僅可簡(jiǎn)單方便地了解羊群是否缺硒，以便采取相應(yīng)的飼養(yǎng)管理措施，而且可以在一定程度上減輕測(cè)定山羊體內(nèi)硒含量的工作量，節(jié)省經(jīng)費(fèi)。

3.2 PHGPx基因在山羊各組織中的表達(dá)以及硒沉積量對(duì)其mRNA表達(dá)量的影響

有學(xué)者以小鼠和人作為研究對(duì)象發(fā)現(xiàn)，在睪丸組織中PHGPx基因的mRNA表達(dá)量極顯著高于其他組織器官[23-26]。本試驗(yàn)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分別檢測(cè)了紫陽(yáng)地區(qū)和寶雞地區(qū)山羊心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、背最長(zhǎng)肌、股二頭肌組織中PHGPx基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明PHGPx基因在山羊的上述組織中均有表達(dá)。但是目前PHGPx基因在動(dòng)物各組織器官中差異性表達(dá)的研究尚未得到統(tǒng)一的結(jié)論。張建新等[21]報(bào)道，PHGPx基因mRNA在太行青山羊組織器官中的表達(dá)量由高到低依次為：心臟>肺臟>腎臟>肝臟>脾臟>肌肉;而Baek等[27]以小鼠為研究對(duì)象發(fā)現(xiàn)，其PHGPx基因mRNA由高到低依次為心臟>肝臟>小腸>腎臟>肺臟；但是陳偉等[20]報(bào)道，PHGPx基因mRNA在萊蕪豬中的表達(dá)規(guī)律為：腦、心、肝、脾>肌肉>脊髓、大腸、背膘、小腸>肺；這些研究結(jié)果均與本試驗(yàn)結(jié)果不完全一致。推測(cè)其可能的原因有：一是物種的差異；二是PHGPx基因在動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)具有時(shí)間和空間的差異性，并且受到很多生理和病理因素的影響；三是本研究的試驗(yàn)對(duì)象來自硒含量不同的地區(qū)，硒含量的差異影響了山羊各組織器官中PHGPx基因表達(dá)的差異性。

大量研究表明，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中調(diào)控蛋白生成的關(guān)鍵步驟主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上[28]。動(dòng)物PHGPx基因的表達(dá)受很多因素的影響，如某些微量元素水平、組織差異和生長(zhǎng)階段等[15,29]，微量元素硒是重要調(diào)控因素之一[30]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組山羊各組織器官中PHGPx基因mRNA的表達(dá)量均低于試驗(yàn) Ⅰ 和 Ⅱ 組，且不同硒含量對(duì)PHGPx基因表達(dá)的調(diào)控有差異。肺臟中沉積的硒上調(diào)了PHGPx基因的表達(dá)，但背最長(zhǎng)肌和股二頭肌中沉積的硒對(duì)PHGPx基因表達(dá)無顯著影響。這可能是因?yàn)榉闻K、腎臟中PHGPx基因mRNA的表達(dá)對(duì)硒的依賴性較肌肉組織大，對(duì)硒含量的變化較敏感。

目前，關(guān)于微量元素硒對(duì)PHGPx基因表達(dá)調(diào)節(jié)的研究尚未得到統(tǒng)一的結(jié)論，Bermano等[31]的研究認(rèn)為，缺硒并不會(huì)影響大鼠心臟和肝臟組織中PHGPx基因mRNA的表達(dá)量；但是Pagmantidis等[32]發(fā)現(xiàn)，缺硒會(huì)顯著降低大鼠結(jié)腸黏膜細(xì)胞中PHGPx基因mRNA的表達(dá)水平(P<0.05)；鄭良焰等[15]以不同硒含量的日糧飼喂小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)日糧中硒含量為0.1 mg/kg時(shí)，小鼠肝臟中PHGPx基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量最高，顯著高于0.045和0.4 mg/kg組(P<0.05)，與本試驗(yàn)的結(jié)果相一致，這預(yù)示著適量攝入硒會(huì)在轉(zhuǎn)錄水平上上調(diào)肝臟中PHGPx基因的表達(dá)。有研究認(rèn)為，硒元素不影響PHGPx基因mRNA的轉(zhuǎn)錄速率，而是在轉(zhuǎn)錄后水平通過影響mRNA穩(wěn)定性來調(diào)節(jié)mRNA的水平[33]，這有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

陜西紫陽(yáng)縣山羊各組織中硒含量均高于寶雞地區(qū)山羊，羊肉中也富含硒元素，表明土壤硒含量會(huì)影響山羊體內(nèi)硒的沉積量。血清中硒含量與其他組織中的硒含量呈正相關(guān)關(guān)系，可以通過測(cè)定血清中的硒含量來推斷山羊其他組織器官中的硒含量。山羊的心臟、肝臟、肺臟組織中沉積的硒元素顯著影響了其PHGPx基因mRNA的表達(dá)量，表明微量元素硒可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控PHGPx基因的表達(dá)，但這種調(diào)控具有組織差異性。

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