李 忠，江立庚，唐榮華，韓柱強(qiáng)，鐘瑞春，賀粱瓊，蔣 菁，熊發(fā)前，唐秀梅

(1 廣西大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧530007；2 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，廣西 南寧530004；3 廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧530007)

花生栽培種是異源四倍體作物，遺傳基礎(chǔ)狹窄,在形態(tài)、抗性、品質(zhì)等性狀上有一定變異，但變異程度較其他作物低，而且許多危害花生的病蟲(chóng)害缺乏抗源[1-2]?；ㄉ吧N具有豐富的遺傳變異，也存在很多栽培花生所不具備的優(yōu)良性狀。前人的研究表明，花生野生種對(duì)一些病蟲(chóng)害的抗性顯著高于栽培種，如對(duì)花生早斑病、晚斑病、銹病等病害高抗或者免疫[1，3-7]。通過(guò)種間雜交或其他生物技術(shù)將花生野生種的抗病基因轉(zhuǎn)移到花生栽培種中，是擴(kuò)大花生栽培種遺傳基礎(chǔ)、種質(zhì)創(chuàng)新和新品種選育的重要途徑。Arachiscorrentina是與花生栽培種雜交親和的少數(shù)野生花生品種之一，在田間表現(xiàn)出耐貧瘠、抗病性好、耐連作等優(yōu)良特性。

植物抗病基因的分離是近年來(lái)植物分子生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn),所采用的技術(shù)手段主要有轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法、圖位克隆法和同源序列克隆法等?？共』蝾愃莆?Resistance gene analog, RGA)分子育種技術(shù)是一種利用已知抗病基因所編碼的蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，并分離和克隆抗病基因及其同源片段的技術(shù)，它為作物品種的性狀改良及抗病機(jī)制的研究提供了新的途徑，且已在包括花生在內(nèi)的許多作物研究方面取得了進(jìn)展[8-16]。這些研究結(jié)果表明，應(yīng)用RGA克隆技術(shù)分離植物抗病基因，并據(jù)此進(jìn)行分子標(biāo)記輔助抗病育種是一種可行且有效的方法。利用RGA克隆技術(shù)分離花生的 RGA，不僅有助于篩選花生各種抗病基因的分子標(biāo)記，建立花生抗病育種分子標(biāo)記輔助體系，而且通過(guò)對(duì)花生 RGA的結(jié)構(gòu)、表達(dá)和調(diào)控的研究，將有助于深入探明花生的抗病機(jī)制。本研究根據(jù)已知抗病基因的保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)引物，在花生野生種A.correntina、栽培種“桂花21”和花生栽野雜交后代中克隆抗病相關(guān)基因片段，以期為花生抗病基因的進(jìn)一步分離、鑒定及利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試花生材料共16個(gè)，其中0901～0914為2009年由花生野生種A.correntina(父本)與栽培種“桂花21”(母本)雜交所得的14個(gè)子7代材料；花生屬花生區(qū)組野生種A.correntina，來(lái)自國(guó)家種質(zhì)野生花生南寧分圃；抗銹病栽培品種“桂花21”由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所育成和提供。

1.2 方 法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 參照文獻(xiàn)[12],依據(jù)植物R(Resistance)基因NBS區(qū)的保守序列設(shè)計(jì)合成1對(duì)引物,引物序列見(jiàn)表1。 引物由上海生物工程有限公司合成。

表1 依據(jù)植物R基因NBS區(qū)的保守序列設(shè)計(jì)的引物

1.2.2 gDNA的提取 取花生幼嫩葉片，用液氮于研缽中磨成粉狀，用CTAB法[17]提取gDNA。

1.2.3 花生抗病基因類似物基因的克隆和測(cè)序 1) PCR 反應(yīng)條件。以花生gDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為:2.5 μL 10×PCR buffer，2.0 μL 25 mmol/L MgCl2，2.5 μL 1.0 mmol/L dNTPs，20 μmol/L 上下游引物各1 μL，1 UTaqDNA聚合酶，約100 ng模板,補(bǔ)足ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 終止反應(yīng)。

2) PCR產(chǎn)物的克隆及測(cè)序。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳(80 V，200 A)40 min，用 OMEGA公司GEL EXTRACTION KIT柱式 DNA凝膠回收試劑盒回收差異 DNA片段。按 TIANGEN公司pGM-T載體試劑盒使用說(shuō)明，將回收的PCR 產(chǎn)物與 pGM-T 載體連接。將連接的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含IPTG(200 mg/L)、氨芐青霉素(100 mg/L)和 X-Gal (20 mg/L)的 LB 固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)12～16 h。挑取5～7個(gè)白色單菌落，進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，檢測(cè)插入片段的有無(wú)和大小。將陽(yáng)性克隆菌用牙簽挑出，置于用1.5 mL離心管制作的LB固體培養(yǎng)基小平板中，送樣至上海Invitrogen公司測(cè)序。

1.2.4 序列比對(duì)與分析 使用DNAstar、DNAclub軟件進(jìn)行序列初步分析,包括DNA至氨基酸轉(zhuǎn)換、ORF分析。應(yīng)用PIR網(wǎng)站(http://pir.georgetown.edu/)進(jìn)行蛋白質(zhì)保守區(qū)結(jié)構(gòu)分析。使用NCBI網(wǎng)站上的BLAST搜索同源序列，并對(duì)各組RGA氨基酸序列與已知R氨基酸序列的同源性進(jìn)行綜合性分析,用DNAMAN構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生RGA的擴(kuò)增與鑒定

利用依據(jù)R基因NBS區(qū)保守序列設(shè)計(jì)合成的引物PLTR，以花生基因組gDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)PCR擴(kuò)增譜帶的分析結(jié)果表明，引物PLTR的PCR產(chǎn)物出現(xiàn)1條500 bp左右的條帶，條帶較清晰，有1個(gè)花生材料0909沒(méi)有條帶(圖1)。目的片段經(jīng)回收、克隆，獲得15個(gè)花生抗病基因類似物基因(13個(gè)來(lái)自栽野雜交后代，2個(gè)分別來(lái)自父母本)，相應(yīng)序列見(jiàn)圖2。圖2表明，15條序列均具有完整開(kāi)放讀碼框(ORF)，這些序列的大小在498～500 bp。將本試驗(yàn)所得基因序列提交NCBI網(wǎng)站，得到4個(gè)GenBank收錄號(hào)，分別為：KF885730.1、KF885729.1、KF885731.1和KF885732.1。對(duì)推導(dǎo)出的15個(gè)花生RGA完整氨基酸序列蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析表明，15條序列含有典型的NBS保守區(qū)的N端糖基化位點(diǎn)(NNSG)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(TTR、SWK、SCK)、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)(TRND、SYDD)、N-豆蔻?；稽c(diǎn)(GLPLAI、GIFPAD)特征序列(圖2)。

圖1 花生RGA的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 花生RGA序列的同源性比較

2.2.1 花生RGA氨基酸序列的相似性 利用 DNAMAN 軟件，對(duì)15條RGA氨基酸序列與GenBank中收錄的有代表性的8條來(lái)自花生的抗病R氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，15個(gè)RGA氨基酸有很高的相似性，序列間的同源性在73.2%～100.0%；2個(gè)親本序列的同源性為73.8%，其中母本“桂花21”與栽野雜交后代材料序列的相似性為73.9%～100.0%，比父本A.correntina(73.2%～98.2%)略高。15條RGA氨基酸序列與已發(fā)表的花生抗病基因氨基酸序列也具有較高的相似性，相似性在72.1%～100.0%，依據(jù)聚類結(jié)果可將這些序列分為2組：在第Ⅰ組中，只有基因0903、A.correntina和0907 聚在一起，序列間的相似性較高，為95.4%～98.2%；其余RGA材料均聚在第Ⅱ組中，序列間的相似性在81.6%～100.0%。第Ⅰ組與第Ⅱ組的相似性為74.0%。

2.2.2 花生與其他作物RGA R序列的相似性 將15個(gè)片段的氨基酸序列輸入NCBI網(wǎng)站的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),利用BLAST進(jìn)行同源性搜索，然后與其他作物的R序列氨基酸(表2)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可以看出，與15條氨基酸序列同源性相對(duì)較高的作物主要有：番茄(Solanumlycopersicum，序號(hào)：1～3)、葡萄(Vitisvinifera，序號(hào)：4～9)、大豆(Glycinemax，序號(hào)：10～14)、毛果楊(Populustrichocarpa，序號(hào)：15～16)、鷹嘴豆(Cicerarietinum，序號(hào)：17～18)、菜豆(Phaseolusvulgaris，序號(hào)：19～22)、馬鈴薯(Solanumtuberosum，序號(hào)：23～27)、煙草NBS抗性基因類似蛋白(Nicotianatabacum，序號(hào)：28～31)、野生馬鈴薯(Solanumalbicans，序號(hào)：32～34)(表2)。通過(guò)氨基酸序列的相應(yīng)區(qū)域BLAST 比對(duì)發(fā)現(xiàn)，15條氨基酸序列與其他植物之間的同源性均較小，在34.1%～54.6%，其中與大豆序列12的氨基酸序列同源性最高，達(dá)51.9%～54.6%；與煙草序列30的氨基酸序列同源性最低，為34.1%～39.1%。聚類結(jié)果可分為4大類，本試驗(yàn)所得的15個(gè)序列聚在一起，其他作物序號(hào)4～22的氨基酸序列聚為一類，這2大類的同源性為45%；序列1～3，23～26及28～34歸為一類，與前述2大類的同源性為43%；序列27單獨(dú)歸為一類，與前述3大類的同源性為41%。這些具有一定程度同源的、來(lái)自于其他物種的抗病基因可能與花生具有近親關(guān)系。

圖2 花生RGA氨基酸序列的比對(duì)分析

圖3 15個(gè)花生RGA氨基酸序列與已知的8個(gè)花生R氨基酸序列的相似性分析

表2 用于與花生RGA序列相似性分析的其他作物的R序列

圖4 花生RGA序列與其他作物的R氨基酸序列的相似性分析

3 討 論

花生野生種的抗病基因可通過(guò)有性雜交轉(zhuǎn)移至栽培品種中[18]，獲得高抗病性的花生新品系，這是花生抗病育種的創(chuàng)新途徑之一。由于大多數(shù)野生種為二倍體，栽培種是四倍體，三倍體栽野種間雜種的育性需要染色體加倍才能恢復(fù)，雜種后代存在遺傳不穩(wěn)定性，野生種基因整合到栽培種基因組中的幾率較低，因此如何準(zhǔn)確地選擇出含有野生種優(yōu)良基因的目標(biāo)單株顯得非常重要。對(duì)花生屬種間抗病基因同源序列進(jìn)行克隆和分析，對(duì)深入明確抗病基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系有重要意義。

本研究中15條氨基酸序列間以及與已發(fā)表的花生抗病基因類似物的同源性，均在72.1%以上，表明花生種間遺傳基礎(chǔ)窄、多態(tài)性水平低，這與其他研究結(jié)果[19-20]相似。15條氨基酸序列與其他作物的R氨基酸序列同源性在34.1%～54.6%，說(shuō)明花生的RGA與其他植物之間的親緣關(guān)系要遠(yuǎn)一些，這與經(jīng)典分類學(xué)的結(jié)果基本一致。

本研究分離到的15個(gè)花生抗病基因同源片段，含有抗病基因保守結(jié)構(gòu)域的N端糖基化位點(diǎn)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、N-豆蔻酰化位點(diǎn)，推測(cè)它們可能為抗病基因的部分序列。而且這些 RGA 的氨基酸序列存在差異，與已知花生的抗病基因相似性較高，與其他作物的RGA序列也存在一定的相似性，推斷這些RGA 基因可能同屬于一個(gè)基因家族。14個(gè)栽野雜交子代材料中有1個(gè)未擴(kuò)增出抗病基因類似序列，各雜交子代間氨基酸序列存在單核苷酸差異位點(diǎn)，說(shuō)明在子代繁育過(guò)程中可能發(fā)生了基因變異。

花生RGA序列的獲得，對(duì)于花生抗病育種實(shí)踐具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。首先，可根據(jù)獲得的RGA克隆設(shè)計(jì)特異引物繼續(xù)擴(kuò)增相關(guān)的抗病基因，獲得基因全長(zhǎng)序列及附近序列；另外，根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)栽野種間抗病基因分子標(biāo)記，有助于在種間雜種后代群體中選擇含有野生種抗病基因的優(yōu)良單株。

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