朱 濤，趙艷豐，唐小牛，谷生麗，王少圣，李朝品

表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis, SE)屬凝固酶陰性葡萄球菌，為條件致病菌，廣泛存在于人皮膚和粘膜表面，其正常情況下很少引起感染。但近年來，隨著醫(yī)用高分子材料(如人工關節(jié)、人工心臟瓣膜和中央靜脈插管等)在臨床上的廣泛應用，表皮葡萄球菌日益成為引起院內感染的重要病原體之一。其致病性主要在于能在醫(yī)用材料表面形成生物膜(biofilm)[1-2]。生物膜的形成受多種環(huán)境因素的影響。雙組分調控系統(tǒng)(Two-component regulatory system,TCS)是細菌感應外界環(huán)境信號，啟動胞內一系列相關基因的轉錄和表達，以增強細菌在不同環(huán)境下的適應能力和調控細菌毒力的一類信號轉導途徑[3-4]。研究表明多個雙組分調控系統(tǒng)YycG/F、ArlS/R和SrrB/A參與調控葡萄球菌生物膜的形成[5-7]。

作者在以往的研究中對表皮葡萄球菌雙組分信號轉導系統(tǒng)LytS/R的生物學功能和調控網絡作了初步分析。研究發(fā)現(xiàn)lytS/R基因被敲除后，其利用丙酮酸作為碳源的能力顯著受損?；蛐酒慕Y果表明參與丙酮酸代謝的相關基因mqo-2和mqo-3的轉錄水平明顯下降。而且鄰近mqo-2的serp2169基因的轉錄水平也下調了60倍，但其功能未知[8]。Petrova等人研究表明丙酮酸以及丙酮酸的發(fā)酵是銅綠假單胞菌形成微菌落，進而形成生物被膜所必須的[9]。因此，為了研究serp2169基因的生物學功能以及是否參與丙酮酸代謝和影響生物膜形成，我們擬構建表皮葡萄球菌serp2169基因敲除突變株，并對突變株的表型進行初步檢測。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1菌株和質粒 表皮葡萄球菌1457株為臨床株，由本實驗室保存；穿梭質粒pMAD-spc、大腸桿菌DH5α和金黃色葡萄球菌RN4220，用于基因敲除。

1.1.2主要試劑和培養(yǎng)基 溶葡萄球菌素(lysostaphin)、Pfu DNA聚合酶、紅霉素(Erythromycin)、X-gal、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司；壯觀霉素(Spectinomycin)購自Sigma公司；限制性內切酶、DNA連接酶、lkb DNA Marker購自Fermentas公司；質粒抽提試劑盒購自Qiagen公司；引物合成和測序由上海生工生物技術有限公司完成；TSB( Tryptic Soy Broth) 為美國BD公司產品；BM培養(yǎng)基：10 g/L 蛋白胨，5 g/L 酵母提取物，5 g /L氯化鈉，1 g/L磷酸氫二鉀，1 g/L葡萄糖。

1.2 方法

1.2.1表皮葡萄球菌serp2169基因的生物信息學分析 根據(jù)表皮葡萄球菌ATCC35984株全基因組序列(GenBank收錄號：CP000029)[10]，找到serp2169基因及其編碼的蛋白序列。采用BlastP在線軟件對其編碼蛋白SERP2169的同源性和蛋白功能域進行分析。

1.2.2表皮葡萄球菌serp2169基因敲除突變株的構建 采用質粒同源重組的方法構建表皮葡萄球菌1457serp2169基因敲除突變株(Fig.1)[11]。根據(jù)NCBI上公布的表皮葡萄球菌基因組序列，在serp2169基因的上下游各設計1對引物，上游引物為serp2169-UF和serp2169-UR，擴增片段長度1 011 bp，作為上游同源臂；下游引物為serp2169-DF和serp2169-DR，擴增片段長度988 bp，作為下游同源臂；擬用spc基因取代819 bp的serp2169目的基因。所用引物采用Primer Premier 5.0軟件設計, 引物序列的下劃線為酶切位點(表1)。

提取表皮葡萄球菌1457株基因組DNA，以該基因組DNA為模板擴增上下游同源臂，克隆入pMAD-spc載體，得到同源重組質粒，命名為pMAD-serp2169。通過電轉將pMAD-serp2169轉入金黃色葡萄球菌RN4220，電轉條件：電壓2 kV，電容25 μF ，電阻100 Ω。在含有10 mg/L紅霉素的BM平板上篩選出轉化成功的菌落后，提取金黃色葡萄球菌RN4220中的pMAD-serp2169并鑒定，再把經修飾的pMAD-serp2169電轉入表皮葡萄球菌1457株，電轉條件同前。

pMAD是溫度敏感型質粒，30℃此質?？梢栽诟锾m陽性菌中穩(wěn)定存在，當溫度≥40℃時質粒很易丟失。該質粒攜帶lacZ基因，編碼β半乳糖苷酶，能分解生色底物X-gal 產生藍色。當同源重組未發(fā)生時，質粒保留在細菌內，或者與基因組只發(fā)生了單交換，lacZ基因表達，菌落呈藍色；當同源重組發(fā)生后，質粒從細菌丟失，無β半乳糖苷酶表達，菌落呈白色。根據(jù)以上原則進行敲除突變株的篩選。取含pMAD-serp2169的表皮葡萄球菌1457株接種含10 mg/L紅霉素的BM培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)過夜。取1 mL上述菌液接種新鮮100 mL含50 mg/L 壯觀霉素的BM培養(yǎng)基，42℃振蕩培養(yǎng)24 h；以下同前，共重復2～3次，每天需換新鮮含50 mg/L壯觀霉素的BM培養(yǎng)基。取少量菌液接種至含50 mg/L壯觀霉素，20 g/L X-gal的TSB平板；挑取單個白色菌落分別接種至含50 mg/L壯觀霉素的和含10 mg/L紅霉素的TSB平板，其中壯觀霉素平板上生長、紅霉素平板上不生長的菌落為初篩重組成功的serp2169基因敲除突變株，命名為SE1457-Δserp2169。

1.1.3表皮葡萄球菌serp2169基因敲除突變株的鑒定 以初篩所得的突變株基因組為模板，以上游同源臂外側的正義引物(serp2169-IF)和spc基因片段的反義引物(spc-IR)，下游同源臂外側的反義引物(serp2169-IR)和spc基因片段的正義引物(spc-IF)，分別采用Pfu DNA聚合酶進行PCR擴增，并以表皮葡萄球菌1457野生株基因組作為陰性對照。所用引物采用Primer Premier 5.0軟件設計,具體序列見表1。如若同源重組成功，spc基因取代了目的基因serp2169，則突變株能夠擴增出預計大小的片段，反之則不能。將PCR產物行1%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)1 kb DNA Marker得出產物大小，并與陰性對照比較。最后對PCR產物進行凝膠回收后測序驗證。

表1 各擴增片段的引物序列及限制性內切酶

Note: This table shows primers and restriction endonuleases used in the present study, and underlined sequences represent the restriction sites. Upstream and downstream fragments of theserp2169 gene were amplified byserp2169-UF,serp2169-URserp2169-DF, andserp2169-DR, respectively. Primersserp2169-IF,spc-IR,spc-IF, andserp2169-IR were used to identifySE1457-Δserp2169 by PCR amplification, respectively.

1.2.3serp2169突變株及其野生株生長曲線和培養(yǎng)液pH值的測定 將過夜培養(yǎng)的菌液接種于含100 mL TSB培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，調節(jié)接種量，使得OD600=0.01。將錐形瓶置于37℃氣浴恒溫振蕩器中，220 r/min振蕩培養(yǎng)，分別于4、8、12、24 h后取樣，以后每隔24 h取樣一次，測定OD600值和pH值，共檢測168 h。

1.1.4serp2169突變株及其野生株生物膜形成的半定量檢測 細菌經過37℃振蕩培養(yǎng)過夜，1∶200稀釋加入96孔板(200 μL/孔，三復孔)，并且用TSB培養(yǎng)基為空白對照，另設表皮葡萄球菌ATCC12228為陰性對照，表皮葡萄球菌ATCC1457為野生株。37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，丟棄菌液，加入PBS(200 μL/孔)，洗去未黏附細菌，重復洗滌3次。然后加入99%甲醇固定15 min，棄甲醇。加入2%結晶紫染色8 min，自來水沖洗板到流水無色，室溫干燥片刻后，酶標儀于570 nm處讀數(shù)[11]。

2 結 果

2.1表皮葡萄球菌serp2169基因的生物信息學分析 BlastP分析表明表皮葡萄球菌serp2169基因的編碼氨基酸序列中4-272位為PRK05339結構域。該結構域暫被認為屬于磷酸烯醇式丙酮酸合成酶調節(jié)蛋白。serp2169的同源基因普遍存在于凝固酶陰性葡萄球菌中，在溶血葡萄球菌中氨基酸序列一致性為87%，在肉葡萄球菌中氨基酸序列一致性為72%，而在金黃色葡萄球菌中未發(fā)現(xiàn)氨基酸序列一致性大于50%的同源基因。對serp2169基因的上下游序列進行分析，serp2169上游為mqo-2基因，編碼蘋果酸:醌氧化還原酶(malate:quinone oxidoreductase)；其下游為ppdk基因，編碼丙酮酸磷酸雙激酶(pyruvate phosphate dikinase)(圖1)。

2.2表皮葡萄球菌serp2169基因敲除突變株的構建和鑒定 經PCR擴增和雙酶切驗證，成功構建了同源重組質粒pMAD-serp2169。轉化了pMAD-serp2169的表皮葡萄球菌于42 ℃條件下連續(xù)傳代，篩選出了對壯觀霉素抵抗但對紅霉素敏感的白色菌落。以同源臂外側基因序列和spc基因序列設計的兩對引物對篩選出的突變株和野生株分別進行PCR擴增，結果顯示篩選出的突變株能夠擴增出長度約2 117 bp和1 933 bp的片段，與預計的片段大小相符，且通過測序證實；而野生株不能擴增出相應的片段 (圖2)。采用梅里埃API STAPH葡萄球菌鑒定試劑條對篩選出的突變菌株進行菌種鑒定，結果顯示為表皮葡萄球菌，證明獲得了SE1457-Δserp2169菌株。

圖1serp2169基因同源重組及其上下游序列分析

Fig.1Homologousrecombinationofserp2169geneinS.epidermidis1457genomewithpMAD-serp2169andtheanalysisofitssurroundingregion

The upstream and downstream fragment ofserp2169 gene andspcwere cloned into vector pMAD-spc, named as pMAD-serp2169.

圖2表皮葡萄球菌serp2169基因敲除突變株的PCR鑒定

Fig.2Identificationofserp2169geneknockingoutintheS.epidermidisbyPCRamplification

Specific fragments were amplified fromSE1457-Δserp2169;

M: 1 kb DNA marker;

Lane 1:serp2169 upstream fragment plusspcfragment (2 117 bp);

Lane 2:serp2169 downstream fragment plusspcfragment (1 933 bp);

Lane 3 and Lane 4: no fragment was amplified from the wild type strain by using the respective primers.

2.3serp2169突變株生長曲線和培養(yǎng)液pH值的研究 在相同接種量和生長條件下比較野生株和突變株的生長曲線，結果顯示兩株細菌的生長曲線在96 h以前基本一致，培養(yǎng)24 h后，濁度值達到最高，突變株OD600=2.602，野生株OD600=2.646，隨后逐漸下降；兩株細菌培養(yǎng)液的pH值也基本一致。而在96 h以后野生株的生長曲線出現(xiàn)反彈，而突變株的生長曲線繼續(xù)下行，培養(yǎng)120 h后，突變株OD600=0.883，野生株OD600=1.701 (圖3)，此時兩株細菌培養(yǎng)液的pH值也出現(xiàn)了差別，突變株pH=8.35，野生株pH=7.96。

圖3表皮葡萄球菌serp2169基因敲除突變株和野生株的生長曲線

Fig.3GrowthcurveofSE1457-Δserp2169andthewildtypestrain

(△):SE1457-Δserp2169;

(○):SE157 wild type strain.

Overnight culture was diluted to OD600=0.01 in 200 mL TSB medium, and incubated at 37 ℃ with shaking.

The value of OD600was detected.

The curves represent one of the three independent experiments.

2.4serp2169突變對表皮葡萄球菌生物膜形成能力的影響 對敲除突變株進行微量板半定量生物膜檢測，觀察細菌在96孔板上靜止生長24 h后生物膜的形成，結果顯示突變株的OD570=2.436，而野生株OD570=2.329，P>0.05，與野生株相比，突變株的生物膜形成能力無顯著變化 (圖4)。

3 討 論

本研究根據(jù)同源重組原理，采用溫度敏感型質粒pMAD結合藍白斑篩選技術，成功獲得了表皮葡萄球菌serp2169基因的敲除突變株，為其下一步生物學功能的研究奠定了基礎。serp2169基因的生物信息學分析表明其編碼產物可能為磷酸烯醇式丙酮酸合成酶調節(jié)蛋白。且其上游的mqo-2基因編碼蘋果酸:醌氧化還原酶，催化蘋果酸氧化生成草酰乙酸，參與三羧酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán)[13]；而下游的ppdk基因編碼丙酮酸磷酸雙激酶，主要分布在特定的微生物和植物體內，可逆地催化ATP、磷酸和丙酮酸轉化為AMP、焦磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸[14-15]，均參與丙酮酸的代謝。表皮葡萄球菌lytS/R突變株利用丙酮酸的能力受限，且serp2169基因的轉錄水平顯著降低。因此，serp2169基因可能參與丙酮酸的代謝，并在表皮葡萄球菌利用丙酮酸作為碳源的代謝過程中發(fā)揮重要調節(jié)作用。但我們觀察了serp2169突變株在丙酮酸利用培養(yǎng)基(10 g/L丙酮酸, 10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母提取物，5 g/L氯化鈉，1 g/L磷酸氫二鉀)中的生長情況，發(fā)現(xiàn)其與野生株并無差異。

圖4serp2169突變對表皮葡萄球菌生物膜形成能力的影響

Fig.4Effectofserp2169geneknockingoutonS.epidermidisbiofilmformation

The biofilm formation ofSE1457-Δserp2169 and its parent strain was detected by semi-quantitative microtiter plate assay.

Briefly, the overnight bacterial were diluted by 1∶200 and cultured in 96-well plate (200 μL/well) at 37 ℃ for 24 h.

The well was washed by PBS for 3 times, fixed by 99% methanol and stained with crystal violet.

Data are means ± SEM of three independent experiments.

進一步，我們對突變株和野生株的生長曲線進行了測定，發(fā)現(xiàn)在對數(shù)期以及平臺期的早期，兩株細菌的生長并無差異；而到了平臺期的后期(96 h)，野生株有一個二次生長的過程，但突變株沒有，兩株細菌的生長曲線出現(xiàn)了差異，同時培養(yǎng)液的pH值突變株也比野生株偏堿性。金黃色葡萄球菌cidC基因編碼丙酮酸激酶，能催化丙酮酸氧化脫羧生成乙酸和二氧化碳。與野生株相比，cidC敲除突變株在平臺期有一個二次生長的過程, 作者認為這是由于突變株中乙酸的濃度適合作為碳源進行能量代謝的結果，而野生株中因cidC基因的存在而造成乙酸濃度過高，從而影響了細菌的生存[16]。空腸彎曲菌在平臺期也有一個二次生長的過程，形成雙峰生長曲線，Martínez-Rodriguez等人也認為這是丙酮酸的代謝產物乙酸在平臺期被作為碳源進行代謝的結果[17-18]。綜上所述，我們推測在表皮葡萄球菌中也存在利用乙酸或者丙酮酸的其他代謝產物作為碳源進行能量代謝的機制，而serp2169基因可能是參與這一機制的關鍵基因。

細菌的代謝狀態(tài)可影響生物膜的形成，抑制三羧酸循環(huán)可促進生物膜形成能力增強[19]。因此，我們檢測了serp2169突變株的生物膜形成情況，發(fā)現(xiàn)與野生株相比無顯著變化，表明serp2169基因可能不影響表皮葡萄球菌生物膜的形成。

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