王艷鳳，王 楠，丁 靜，孫 堯，劉曉雷，王學(xué)林，劉明遠(yuǎn)，白 雪

旋毛蟲病是由旋毛蟲(Trichinella)引起的一種呈全球性分布的食源性人獸共患寄生蟲病，因食入含有旋毛蟲感染性肌幼蟲的生的或半生的肉類引起。旋毛蟲在感染不同時(shí)期，釋放許多生物活性物質(zhì)調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)并入侵宿主肌細(xì)胞為自己構(gòu)建了一個(gè)安全的包囊來達(dá)到成功的寄生。包囊的形成是一個(gè)復(fù)雜的過程，其排泄分泌物及其誘導(dǎo)宿主細(xì)胞釋放的效應(yīng)分子在感染肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)換及其周圍環(huán)境的改變中發(fā)揮著重要的作用[1]。體外實(shí)驗(yàn)表明，旋毛蟲肌幼蟲蟲體粗提物能夠刺激巨噬細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和成纖維生長(zhǎng)因子2(FGF2)，其中VEGF可能與維持保姆細(xì)胞(nurse cells)的低氧環(huán)境及刺激釋放I型膠原的纖維母細(xì)胞的增殖有關(guān)，這些結(jié)果表明旋毛蟲感染肌細(xì)胞周圍的巨噬細(xì)胞對(duì)包囊的形成有著重要的影響[2]。

目前旋毛蟲不同時(shí)期的排泄分泌物(即ES產(chǎn)物)影響宿主細(xì)胞功能的研究相對(duì)甚少。另外免疫細(xì)胞與成肌細(xì)胞共培養(yǎng)是近幾年來建立的一種體外研究免疫生理的新技術(shù)，是研究細(xì)胞間相互作用的有力手段。因此，本研究通過分離培養(yǎng)旋毛蟲肌幼蟲時(shí)期的ES產(chǎn)物，體外研究與旋毛蟲ML ES作用后的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)成肌細(xì)胞分化的影響，利用共培養(yǎng)技術(shù)，建立了巨噬細(xì)胞與成肌細(xì)胞共培養(yǎng)模型，探討與肌幼蟲排泄分泌物作用的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)成肌細(xì)胞分化的影響，這些研究為深入了解ES產(chǎn)物的功能同時(shí)為旋毛蟲入侵后包囊形成機(jī)理提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與旋毛蟲蟲種 小鼠巨噬細(xì)胞株J774A.1和小鼠成肌細(xì)胞C2C12購(gòu)自ATCC(American Type Culture Collection)，本室常規(guī)傳代。Wistar大鼠，購(gòu)自長(zhǎng)春生物制品研究所，用于旋毛蟲傳代保種及旋毛蟲不同時(shí)期排泄分泌物的收集。中國(guó)河南豬旋毛蟲分離株T.spiralis(ISS534)，由本室傳代保種。

1.1.2主要試劑 嵌入小皿和共培養(yǎng)板、25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板(6孔和24孔)購(gòu)自COSTAR公司產(chǎn)品；RPMI-1640培養(yǎng)液、Hoechst 33342購(gòu)自Sigma公司；細(xì)胞蛋白裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG以及羊抗兔IgG購(gòu)自Santa Cruz公司；正常山羊血清購(gòu)自鼎國(guó)；高糖DMEM培養(yǎng)基、馬血清購(gòu)自GIBCO公司；鼠抗Myosin Heavy Chain單抗購(gòu)自Upstate公司；鼠抗Myogenin單抗均自美國(guó)Santa Cruz公司；兔抗MyoD多抗均自美國(guó)Santa Cruz公司；Alexa Fluor 555-羊抗兔IgG和Alexa Fluor 488-羊抗鼠IgG購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌物(ML ES)的收集 取旋毛蟲ISS534保種的Wistar系大鼠1只，脫頸致死，留胴體和膈肌用人工消化液(10 g/L胃蛋白酶和10 mL/L濃鹽酸)在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱里消化2 h后，過篩并采用自然沉淀的方法收集感染性肌幼蟲，低倍顯微鏡檢查并計(jì)數(shù)后，經(jīng)口感染W(wǎng)istar系大鼠8 000條/只，共10只。與感染后35 d剖殺收集肌幼蟲，將肌幼蟲洗凈并用含200 U/mL青霉素，200 U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后離心，收集的培養(yǎng)液上清作為ML ES備用。

1.2.2小鼠J774A.1巨噬細(xì)胞以及成肌細(xì)胞C2C12的復(fù)蘇及培養(yǎng) 取出液氮罐中凍存的小鼠J774A.1巨噬細(xì)胞以及成肌細(xì)胞C2C12，立刻置于37 ℃的恒溫水浴鍋中，迅速晃動(dòng)，當(dāng)細(xì)胞完全解凍后轉(zhuǎn)入含有DMEM培養(yǎng)液的離心管中，水平離心800 r/min，8 min，棄上清。用含有100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素、10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后經(jīng)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞匯合度達(dá)到90%時(shí)0.25%胰酶消化繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞傳代培養(yǎng)2～3次后用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.3旋毛蟲肌幼蟲期排泄分泌物(ML ES)處理巨噬細(xì)胞 將復(fù)蘇培養(yǎng)后的J774A.1巨噬細(xì)胞按每孔0.5×105個(gè)細(xì)胞接種于12 mm嵌入小皿并放入24孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)約20 h后，其中一些嵌入小皿中加含有ML ES(5 μg/mL)的10% DMEM培養(yǎng)基，孵育24 h，另一些嵌入小皿中加含相同體積PBS的10%DMEM培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。

1.2.4J774A.1-C2C12共培養(yǎng)模型的建立與分組 將小鼠成肌細(xì)胞C2C12按每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于含有經(jīng)多聚賴氨酸處理的蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中(用于細(xì)胞免疫熒光分析)或2×105接種于6孔板(用于Western blot分析)，待細(xì)胞貼壁后，將其分成3組：標(biāo)記A(ML ES處理組)、標(biāo)記B(PBS處理組)、標(biāo)記C(非共培養(yǎng)組)。方法如下：吸出(A)組的C2C12成肌細(xì)胞原生長(zhǎng)培養(yǎng)液后，將含有ML ES的J774A.1巨噬細(xì)胞嵌入皿小心移入24孔板或6孔板中央，之后在培養(yǎng)板和嵌入小皿之間加入分化培養(yǎng)基；吸出(B)組的C2C12成肌細(xì)胞原培養(yǎng)液后，將含有PBS的J774A.1巨噬細(xì)胞嵌入小皿小心移入24孔或6孔培養(yǎng)板中央，之后在培養(yǎng)板和嵌入皿之間加入分化培養(yǎng)基；(C)組為單純分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)的小鼠成肌細(xì)胞C2C12(非共培養(yǎng))。各組均按1 d、3 d、6 d 3個(gè)時(shí)間段標(biāo)記后，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.5細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)與ML ES處理的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)成肌細(xì)胞分化及成肌調(diào)節(jié)因子的影響 共培養(yǎng)1 d、3 d、6 d后，取對(duì)照組和處理組的C2C12細(xì)胞，PBS洗滌3次，加入4%的多聚甲醛固定0.5 h，吸走多聚甲醛，PBS洗滌3次。浸泡在0.1%Triton X-100中，4 ℃通透20 min后PBS洗3次。用封閉液(含5%正常山羊血清)室溫封閉30 min。吸出封閉液，封閉液稀釋以下一抗：兔抗MyoD多克隆抗體(1∶50)、鼠抗Myogenin單克隆抗體(1∶100)、鼠抗肌球蛋白重鏈MHC單克隆抗體(1∶100)4℃孵育過夜。次日用PBS洗3次，每次10 min。滴加Alexa Fluor 555 Goat anti-rabbit IgG或Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG(封閉液1∶200稀釋)，避光孵育30 min。PBS洗3次，每次10 min。Hoechst 33342室溫復(fù)染5 min，PBS洗2次，每次10 min。甘油封片，將細(xì)胞板置于激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.6Western blot分析與旋毛蟲ML ES處理的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)成肌細(xì)胞分化以及成肌調(diào)節(jié)因子的影響 共培養(yǎng)1 d、3 d、6 d后，收集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的C2C12細(xì)胞，經(jīng)裂解液(用時(shí)提前加入PMSF，終濃度為1 mmol/L)獲取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法對(duì)所抽提蛋白質(zhì)的濃度進(jìn)行測(cè)定。獲取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行12%SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(PVDF膜)上，室溫封閉2 h；封閉液稀釋以下一抗：兔抗MyoD多克隆抗體(1∶100)、鼠抗Myogenin單克隆抗體(1∶500)、鼠抗肌球蛋白重鏈MHC單克隆抗體(1∶200)，4 ℃孵育過夜；次日用PBST洗膜3次，每次10 min；瀝干后將轉(zhuǎn)移膜用辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠或者辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(封閉液1∶5 000稀釋)室溫孵育2 h；同樣用PBST洗膜3次，每次10 min，隨后用ECL化學(xué)發(fā)光顯示試劑盒顯色，觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)與旋毛蟲ML ES處理的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)成肌細(xì)胞分化及成肌調(diào)節(jié)因子的影響 通過細(xì)胞免疫熒光分析在共培養(yǎng)1 d、3 d、6 d后，ML ES處理的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)小鼠成肌細(xì)胞C2C12的MyoD、Myogenin和MHC表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，與正常分化的對(duì)照組相比，MyoD(如圖1)、Myogenin(如圖2)和MHC(如圖3)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少。

圖1與肌幼蟲排泄分泌物處理的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)C2C12成肌細(xì)胞MyoD表達(dá)的影響

Fig.1Effectofco-culturedmacrophagestreatmentwithESproductsfrommusclelarvaeofT.spiralisontheexpressionofMyoDofC2C12myoblast

2.2Western blot分析與旋毛蟲ML ES處理的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)成肌細(xì)胞分化以及成肌調(diào)節(jié)因子的影響 Western blot分析進(jìn)一步檢測(cè)了這些因子的表達(dá)變化。如圖4所示，ML ES處理的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)組，MyoD、Myogenin以及MHC蛋白的表達(dá)明顯低于對(duì)照組蛋白的表達(dá)。

3 討 論

目前對(duì)巨噬細(xì)胞與肌細(xì)胞的相互作用，已經(jīng)有了深入的研究，但在旋毛蟲感染肌細(xì)胞后，巨噬細(xì)胞對(duì)生肌程序的調(diào)節(jié)國(guó)內(nèi)外尚未報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室先前的研究已表明巨噬細(xì)胞是旋毛蟲免疫調(diào)節(jié)的靶細(xì)胞，那么ES產(chǎn)物調(diào)節(jié)的巨噬細(xì)胞不但在免疫逃逸中發(fā)揮重要的作用，同時(shí)在感染肌細(xì)胞表型的改變中同樣發(fā)揮著重要的角色[1-2]。衛(wèi)星細(xì)胞的再生與分化完全依靠于其周圍的環(huán)境，詳細(xì)的了解旋毛蟲ES產(chǎn)物作用后的巨噬細(xì)胞及其因子與成肌細(xì)胞的相互作用將有助于我們從整體上理解旋毛蟲感染后肌細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化機(jī)制，而不是單單的集中在寄生蟲與肌細(xì)胞的相互作用。

圖2與肌幼蟲排泄分泌物處理的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)C2C12成肌細(xì)胞Myogenin表達(dá)的影響

Fig.2Effectofco-culturedmacrophagestreatmentwithESproductsfrommusclelarvaeofT.spiralisontheexpressionofMyogeninofC2C12myoblast

圖3與肌幼蟲排泄分泌物處理的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)C2C12成肌細(xì)胞MHC表達(dá)的影響

Fig.3Effectofco-culturedmacrophagestreatmentwithESproductsfrommusclelarvaeofT.spiralisontheexpressionofMHCofC2C12myoblast

損傷肌肉的修復(fù)完全依靠于衛(wèi)星細(xì)胞，這些細(xì)胞位于基底膜，正常情況下是靜止的，當(dāng)組織受到損傷時(shí)這些細(xì)胞被激活、增殖、分化、融合成新的肌管[3]。在這個(gè)過程中，巨噬細(xì)胞及其釋放的因子被認(rèn)為起到了重要的作用[4]。在肌肉組織的損傷修復(fù)過程中，首先巨噬細(xì)胞被經(jīng)典激活，這些經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞去清理壞死的肌肉碎片同時(shí)釋放促炎性細(xì)胞因子如TNF-α和白血病抑制因子(LIF)來促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞的增殖，而且這些因子可以下調(diào)MyoD和Myogenin的表達(dá)，抑制肌細(xì)胞的分化[5-6]。

圖4與肌幼蟲排泄分泌物處理的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)C2C12成肌細(xì)胞MyoD，Myogenin與MHC表達(dá)的影響

Fig.4Effectofco-culturedmacrophagestreatmentwithESproductsfrommusclelarvaeofT.spiralisontheexpressionofMyoD,MyogeninandMHCinC2C12myoblast

本研究應(yīng)用共培養(yǎng)技術(shù)，成功構(gòu)建了J774A.1巨噬細(xì)胞-C2C12成肌細(xì)胞共培養(yǎng)模型，在分化條件下，觀察ML ES處理的巨噬細(xì)胞在共培養(yǎng)體系中對(duì)小鼠成肌細(xì)胞C2C12的成肌調(diào)節(jié)因子(MRFs)和肌球蛋白重鏈(MHC)表達(dá)的影響。MyoD作為成肌細(xì)胞分化的早期標(biāo)志物，在分化的早期12 h表達(dá)上調(diào)[7]。中晚期Myogenin對(duì)成肌細(xì)胞的終末分化進(jìn)行調(diào)節(jié)，在分化期間持續(xù)表達(dá)[8]；MHC則為終末分化標(biāo)記物。細(xì)胞免疫熒光以及Western blot結(jié)果表明在分化條件下，與對(duì)照組比較，與ML ES處理的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)能夠抑制其成肌調(diào)節(jié)因子MyoD、Myogenin和MHC的表達(dá)，即在共培養(yǎng)模型中，ML ES產(chǎn)物處理的巨噬細(xì)胞抑制了生肌進(jìn)程。結(jié)論表明，在旋毛蟲入侵后的肌肉組織修復(fù)及保姆細(xì)胞的形成過程中，巨噬細(xì)胞發(fā)揮了重要且復(fù)雜的角色，且ES產(chǎn)物處理后的巨噬細(xì)胞釋放的分化抑制因子對(duì)宿主肌肉組織修復(fù)及旋毛蟲包囊形成是非常重要的。

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