曹得萍，樊海寧，毋德芳，趙海龍，白海燕

包蟲(chóng)病(Echinococcosis)是細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)(Echinococcusgranulosus) 和多房棘球絳蟲(chóng)(Echinococcmultilocularis)的幼蟲(chóng)寄生于人及食草的家畜類(lèi)及嚙齒類(lèi)動(dòng)物等宿主體內(nèi)所致的一種嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲(chóng)疾病，我國(guó)西北廣大牧區(qū)是包蟲(chóng)病的主要流行區(qū)，是西部地區(qū)人群因病致貧、因病返貧的主要原因。青海高原是世界罕見(jiàn)的棘球蚴病(包蟲(chóng)病)高發(fā)流行區(qū)，1995-2005年青海省棘球蚴病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明[1]，青海省棘球蚴病區(qū)遍布全省各地，人群棘球蚴病患病率在0.18%～8.23%之間，平均患病率為3.28%。

棘球絳蟲(chóng)不同種及亞種有不同的流行病學(xué)特征，其致病性也存在較大差異，其分類(lèi)學(xué)研究必須在掌握多項(xiàng)指標(biāo)的情況下重新鑒定新種和蟲(chóng)株，以揭示其生物學(xué)、遺傳學(xué)和生理學(xué)特征，了解不同地域和不同宿主的變異特點(diǎn)。這不僅促進(jìn)寄生蟲(chóng)分類(lèi)學(xué)的進(jìn)展，而且對(duì)我們認(rèn)識(shí)棘球絳蟲(chóng)和棘球蚴病的流行病學(xué)及找出合理的預(yù)防措施有重要意義[2]。線(xiàn)粒體DNA(mtDNA)基因常被應(yīng)用于分類(lèi)和系統(tǒng)發(fā)生研究，線(xiàn)粒體DNA測(cè)序法也被用于檢測(cè)棘球絳蟲(chóng)屬的遺傳變異。本文利用細(xì)胞色素氧化酶亞單位 Ⅰ (COX Ⅰ )分子標(biāo)記對(duì)收集到的59份流行于青海省棘球蚴樣本和網(wǎng)上下載的13條棘球絳蟲(chóng)細(xì)胞色素氧化酶 Ⅰ 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)探討和分析。

1 材料和方法

1.1樣本來(lái)源 本研究中59份棘球蚴標(biāo)本(35份來(lái)自青海省西寧市各大醫(yī)院包蟲(chóng)病手術(shù)標(biāo)本；24份綿羊包蟲(chóng)病標(biāo)本來(lái)青海省個(gè)屠宰場(chǎng)和西寧市冷庫(kù))。

1.2基因組DNA抽提和PCR擴(kuò)增、測(cè)序 利用天根細(xì)胞組織提取基因組試劑盒按說(shuō)明書(shū)逐步提取棘球蚴基因組DNA,提取的基因組DNA用于細(xì)胞色素氧化酶亞單位 Ⅰ (COX Ⅰ )基因擴(kuò)增，引物序列[3]F5-TATTGGAGATTATGGAGCTG-3，R：5′-AAAGCGGGCGCGCGGTGCTG-3′，PCR產(chǎn)物送上海生工生物公司測(cè)序。

1.3COX Ⅰ基因序列比對(duì)分析 本研究涉及72條序列，其中59條序列是青海省不同地區(qū)人體級(jí)綿羊分離株的序列，其余13條序列從GenBank下載(見(jiàn)表1)。所有細(xì)胞色素氧化酶亞單位Ⅰ(COX Ⅰ )序列均采用Clustal X (Thompson et al. 1997)[4]進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)時(shí)采用默認(rèn)參數(shù)。在PAUP*4.0B10(Swofford, 2002)[5]中對(duì)每個(gè)序列的堿基組成和序列變異情況，并對(duì)序列所有位點(diǎn)堿基組成穩(wěn)定性進(jìn)行卡方統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)(chi-square tests:χ2)。運(yùn)用SeqVis v.1.3 (Ho et al. 2006)[6]軟件進(jìn)行序列異質(zhì)性檢驗(yàn)，使用軟件DAMBE (Xia and Xie, 2001)[7]對(duì)COX Ⅰ序列進(jìn)行單倍型分析，使用Modeltest 3.7 (Posada and Crandall, 1998)[8]程序依據(jù)AIC (Akaike information criterium; Alaike, 1974 ) 和PAUP軟件選擇NJ和Bayesian分析的核苷酸進(jìn)化最適模型。由Mrbayes-3.1.2 (Ronquist and Huelsenbeck, 2003)[9]軟件來(lái)進(jìn)行Bayesian分析。

表1 來(lái)自GenBank12株棘球絳蟲(chóng)蟲(chóng)株來(lái)源、數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)信息表

2 結(jié) 果

2.1堿基組成和飽和檢驗(yàn) 本研究共72條COX Ⅰ序列用于系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的分析研究。利用SeqVis (Hoetal., 2006) 程序進(jìn)行所有序列異質(zhì)性分析，得到序列的異質(zhì)性好，故所有序列將用于系統(tǒng)發(fā)育分析(圖1)。在869個(gè)位點(diǎn)中，375個(gè)可變?yōu)辄c(diǎn)，245個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。用于分析的序列長(zhǎng)度在654 bp (CH2) 至850 bp(網(wǎng)上下載13條序列)。4個(gè)堿基頻率是：A=0.16，C=0.107，G=0.245和T=0.488(各堿基總和為1)，棘球絳蟲(chóng)COX Ⅰ基因堿基組成A+T 略大于C+G。所有序列的轉(zhuǎn)換和顛換比的平均似然估算值為25.559。所有樣本的全部編碼位點(diǎn)的堿基頻率具有同質(zhì)性(χ2=59.53，df =213，P=1.00)(圖3)。應(yīng)用DAMBE軟件進(jìn)行單倍型分析，從72條序列挑出71個(gè)單倍型。平均遺傳距離為0.054，豬帶絳蟲(chóng)(AB086256)和人體包蟲(chóng)病樣本13(CH13)之間遺傳距離最大是0.437。

圖1利用SeqVis(Hoetal.,2006)程序得到的細(xì)胞色素氧化酶亞單位Ⅰ(COXⅠ)基因數(shù)據(jù)四面體點(diǎn)圖

Fig.1TetrahedralplotsforCOXⅠgenedataset,whichwereobtainedusingtheSelectSitescommandfromtheViewMenuintheprogramSeqVis(Hoetal,2006)

2.2系統(tǒng)發(fā)育分析 比對(duì)好的序列(72條序列：本實(shí)驗(yàn)測(cè)序59條中國(guó)株，13條外國(guó)株自網(wǎng)上下載)應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)育分析。不同方法構(gòu)建的拓?fù)錁?shù)基本上是相似的，采用臨接法和貝葉斯法構(gòu)建Bayesian樹(shù)(圖3)得到一致樹(shù)在多數(shù)節(jié)點(diǎn)上有很高的后驗(yàn)概率(posterior probablities, PP)。聚類(lèi)分析的結(jié)果是，采集的標(biāo)本除了ZH4、CH15和CH13與AB018440(多房棘球絳蟲(chóng))聚在一枝(PP=1.00)，其余56株蟲(chóng)體與AB297617(細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)G1株)聚在一枝(PP=1.00)。而在流行于青海省的這些細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)蟲(chóng)株之間又形成姐妹枝(PP>0.60)。AB297617(G1)和AB732958(非洲獅子株)鄰接，說(shuō)明這兩蟲(chóng)株之間的遺傳距離近。G6、G7、G8、G10四株聚在一枝與E.ortleppi(AB235846)形成姐妹枝。

3 討 論

線(xiàn)粒體DNA(mtDNA)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、以母系方式遺傳, 核苷酸歧異度大、進(jìn)化速度快，這就使得線(xiàn)粒體DNA在種內(nèi)、種間、群體間和群體內(nèi)具有廣泛的多態(tài)性，可以作為一個(gè)可靠的遺傳標(biāo)記，廣泛應(yīng)用于寄生蟲(chóng)的種類(lèi)鑒定中[10]。

本研究在前人[11-12]研究的基礎(chǔ)上開(kāi)展了流行于青海高原地區(qū)棘球絳蟲(chóng)基因多態(tài)性及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的探討。本研究對(duì)收集到的59份包蟲(chóng)病樣本(35份來(lái)自病人肝臟或肺臟，24份來(lái)自綿羊肝臟或肺臟)，結(jié)果顯示在我省主要流行的棘球絳蟲(chóng)蟲(chóng)株主要以細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)G1型和多房棘球絳蟲(chóng)為主，細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)G1型為普通綿羊株。我們采集到的標(biāo)本主要都?xì)w屬于細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)G1型，但它們的基因型各不相同，在N-J樹(shù)和貝葉斯樹(shù)中均形成梳齒狀的支序關(guān)系，這就說(shuō)明流行于青海省的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)中有眾多的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)G1型亞型存在。

圖2貝葉斯MrBayesv.3.1.2分析COXⅠ基因數(shù)據(jù)得到的50%多數(shù)一致樹(shù)，節(jié)點(diǎn)樹(shù)字代表貝葉斯后驗(yàn)概率

(CH/ZH代表棘球蚴來(lái)自人體；SH/SP代表棘球蚴來(lái)自綿羊肝臟和肺臟)

Fig.2The50%majority-ruleconsensustreeinferredfromBayesianinferenceofcytochromeoxydaseenzymeⅠ(COXⅠ)genedatasetbyusingMrBayesv.3.1.2

Numbers at nodes represent Bayesian posterior probabilities. (CH/ZH: human samples; SH/SP: sheep's liver or sheep's lung samples)

青南高原有其獨(dú)特的地理景觀和生態(tài)條件，這里動(dòng)物資源十分豐富，人和動(dòng)物棘球蚴的感染十分嚴(yán)重，在寄生蟲(chóng)長(zhǎng)期繁衍演化的過(guò)程中，很可能發(fā)生細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的種內(nèi)變異，產(chǎn)生不同的蟲(chóng)株。王虎[1]等研究顯示，在青海不同地理區(qū)域均存在人與動(dòng)物的囊型棘球蚴病和泡型棘球蚴病、細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)和多房棘球絳蟲(chóng)的流行與感染，表明青海省是囊型和泡型棘球蚴病的混合流行區(qū)，但以囊型棘球蚴病/細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)為主。本研究的最大遺憾是收集包蟲(chóng)病標(biāo)本的中間動(dòng)物宿主的種類(lèi)較少，故在本次分析中沒(méi)有出現(xiàn)石渠細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)蟲(chóng)株出現(xiàn)。我國(guó)青藏高原發(fā)現(xiàn)的石渠棘球絳蟲(chóng)(E.shiquicus)則分別需要藏狐和高原鼠兔作為終末宿主和中間宿主，到目前為止，未發(fā)現(xiàn)人體和犬感染石渠棘球絳蟲(chóng)的證據(jù)[14]。由于棘球絳蟲(chóng)的終寄主和中間寄主較多，有很多問(wèn)題仍然缺乏完整、 有說(shuō)服力的證據(jù)，其種株分析鑒定今后仍是一個(gè)較為復(fù)雜的課題。

總之，本研究表明青海高原細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)以G1型為主，各細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ基因型存在眾多多樣性，可能是由于本地方居住人群的特殊生活方式及地理環(huán)境造成的。青海省細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)基因多樣性也給本地區(qū)包蟲(chóng)病的預(yù)防控制帶來(lái)巨大的困難。故研究本地區(qū)棘球絳蟲(chóng)基因多樣性和各蟲(chóng)株之間的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)關(guān)系為包蟲(chóng)病的有效預(yù)防控制奠定良好的基礎(chǔ)。

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