棘球?qū)俳{蟲分子種系發(fā)生研究進(jìn)展

李 立，婁忠子，閆鴻斌，范彥雷，李建秋，殷 宏，賈萬(wàn)忠

棘球蚴病(包蟲病)是由隸屬于扁形動(dòng)物門(Platyhelminthes)絳蟲綱(Cestoda)帶科(Taeniidae)棘球?qū)?Echinococcus)絳蟲的中絳期或幼蟲寄生于動(dòng)物和人的肝、肺等臟器所引起，是一種嚴(yán)重危害人和動(dòng)物健康的人獸共患寄生蟲病，呈全球性分布，而我國(guó)是該病的高發(fā)區(qū)[1-2]。盡管早在公元前古希臘醫(yī)生希波克拉底(Hippocrates)、阿雷提烏斯(Aretaeus)和伽林(Galen)等就認(rèn)識(shí)到人的這種疾病，但棘球蚴病的病原體，即棘球?qū)俳{蟲的確定及分類是近幾個(gè)世紀(jì)完成的，研究人員對(duì)棘球?qū)俳{蟲內(nèi)種的成員已經(jīng)基本澄清，對(duì)其研究歷經(jīng)了早期對(duì)蟲體的描述即形態(tài)學(xué)方面的觀察和分類，之后蟲種和蟲株的識(shí)別以及近期現(xiàn)代分子生物學(xué)的研究[4-6]。

近年來(lái)，以自動(dòng)化脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid, DNA)測(cè)序技術(shù)和統(tǒng)計(jì)計(jì)算機(jī)算法為基礎(chǔ)的生物信息學(xué)取得的飛速發(fā)展，從根本上改變了對(duì)生物體如何進(jìn)行分類，影響著如何能夠重建較高級(jí)分類單元到種和居群的進(jìn)化關(guān)系[7-8]。隨著對(duì)棘球?qū)俳{蟲分子生物學(xué)研究的深入，逐漸加深了人們對(duì)其種群多樣性的認(rèn)識(shí)和理解，最終取得了棘球?qū)俳{蟲種階元及種系發(fā)生關(guān)系的一致性認(rèn)識(shí)。鑒于棘球?qū)賰?nèi)含有形態(tài)學(xué)上不易區(qū)分的隱藏種的存在，分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)鑒定蟲種必不可少。因此，本文作者將從系統(tǒng)發(fā)生種概念這一角度入手，對(duì)棘球?qū)俳{蟲9個(gè)有效種的確立及其分子種系發(fā)生研究方面所取得的重要進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 種系發(fā)生概念

種系發(fā)生也被稱作系統(tǒng)發(fā)生，是指在地球歷史發(fā)展過(guò)程中生物種系的發(fā)生和發(fā)展。通過(guò)形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)、生理學(xué)特征以及DNA序列等數(shù)據(jù)特征，為生物建立一棵種系發(fā)生樹(演化樹)，以描述各個(gè)物種之間可能有的親緣關(guān)系。其中以分子數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)的種系發(fā)生稱為分子種系發(fā)生(Molecular phylogeny)。由于種系發(fā)生的進(jìn)化過(guò)程是不能被直接通過(guò)觀察和實(shí)驗(yàn)所證實(shí)的，所以需要將各個(gè)方面的證據(jù)都綜合起來(lái)分析。此外，由于針對(duì)這些證據(jù)的側(cè)重點(diǎn)不同，經(jīng)常會(huì)產(chǎn)生不同的演化(進(jìn)化)樹版本。物種簡(jiǎn)稱“種”，是生物分類的基本單位，關(guān)于物種的定義有多種，其中較為常用的物種概念有兩種——系統(tǒng)發(fā)生(物)種概念(Phylogenetic species concept, PSC)和生物種概念(Biological species concept)。系統(tǒng)發(fā)生種(Phylogenetic species，系統(tǒng)發(fā)育種，又譯為分支物種概念或者進(jìn)化物種概念)被定義為最小集物種，是不可再分的(基本的)一群生物，與其他這樣的生物群可明確鑒別，群內(nèi)成員來(lái)自共同祖先。而與此相對(duì)應(yīng)的另一物種概念——生物學(xué)種(Biological species)概念由邁爾[9]提出，他認(rèn)為物種實(shí)際上是彼此已進(jìn)行雜交或彼此可能雜交的一組自然群體，它們跟其它這類群體在生殖上是隔離的。這個(gè)定義假設(shè)只適用于進(jìn)行有性生殖的物種，定義生物學(xué)種的關(guān)鍵在于兩個(gè)種群間沒(méi)有顯著的基因物質(zhì)交流。以單系群(Monophyly)為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)生種概念要比生物學(xué)種概念靈活，這個(gè)觀念不需要考慮到生物的性別，而是以找尋個(gè)體的共同祖先為原則，允許親緣關(guān)系近的種之間可能雜交[10]。鑒于棘球?qū)俳{蟲獨(dú)特的繁殖方式，即成蟲階段行自體交配和幼蟲階段行無(wú)性繁殖，因而本文將主要針對(duì)種系發(fā)生物種概念來(lái)對(duì)棘球?qū)俳{蟲分類學(xué)進(jìn)行論述。

2 棘球?qū)俚囊话闾卣髋c種的鑒定

2.1棘球?qū)俳{蟲一般特征 棘球絳蟲生活史中蟲體發(fā)育要經(jīng)歷兩個(gè)重要階段：成蟲期和中絳期(幼蟲期、蚴期)。棘球絳蟲成蟲為小型蟲體，一般由頭節(jié)、頸節(jié)和3～5個(gè)體節(jié)組成，體長(zhǎng)不超過(guò)1 cm，這在帶科絳蟲很特別，而其它帶科絳蟲多為大型絳蟲，體節(jié)數(shù)成百上千，體長(zhǎng)可超過(guò)1 mm。棘球絳蟲中絳期為包囊形式，包囊有3種類型包括單囊型(如細(xì)粒棘球絳蟲)、多囊型(如伏氏棘球絳蟲)和多房型(泡球型，只有多房棘球絳蟲)[11-12]，雖然這些包囊形態(tài)不同，但均具有相同的包囊結(jié)構(gòu)。食肉動(dòng)物和被獵食的哺乳動(dòng)物是維持棘球絳蟲生活史所不可或缺的兩類宿主，成蟲寄生于食肉動(dòng)物而中絳期寄生于草食動(dòng)物、雜食動(dòng)物包括人等。

2.2棘球?qū)俳{蟲蟲株及基因型 由于棘球?qū)俳{蟲尤其是細(xì)粒棘球絳蟲種內(nèi)變異現(xiàn)象非常普遍，因此同種異名或者不同種同名現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，報(bào)道中常引入亞種、蟲株或者基因型等概念。但是，這些報(bào)道中的不少亞種其獨(dú)立性不能成立。雖然蟲株概念不是寄生蟲分類學(xué)上的正式階元，但是它在人們的實(shí)踐活動(dòng)中被廣泛地接受和使用。后來(lái)的研究也表明，細(xì)粒棘球絳蟲蟲株在不同的地理環(huán)境和宿主中，存在著實(shí)質(zhì)性的基因遺傳多樣性差異，其基因型與原來(lái)各蟲株間保持著相互對(duì)應(yīng)的關(guān)系，且兩者之間極為一致。不同蟲株(基因型)在幼蟲(包囊)形態(tài)、對(duì)人和動(dòng)物的致病性、宿主范圍、流行病學(xué)意義等方面存在差異(見表1)，對(duì)疫苗、診斷試劑及抗蟲藥物的研制和開發(fā)具有重要意義[13]。目前，業(yè)已發(fā)現(xiàn)的基因型或者蟲株(Strains)至少有10個(gè)(G1-G10)[14-18]，這些蟲株以它們所寄生的中間宿主的名稱進(jìn)行命名。此外，廣義的細(xì)粒棘球絳蟲還包括獅株(Lion strain)[19-20]，但它是以終末宿主的名字進(jìn)行命名的。在細(xì)粒棘球絳蟲廣義種內(nèi)，其中的一部分蟲株(基因型)可以升格或者重新修正為單一種。因此，根據(jù)最新研究結(jié)果認(rèn)為，棘球?qū)俳{蟲至少包括9個(gè)有效種，每一個(gè)種都有著不同的宿主—寄生蟲相互關(guān)系(見表1)。

2.3種的識(shí)別和鑒定

直到現(xiàn)在，關(guān)于棘球?qū)俚姆诸惾杂袪?zhēng)議，這主要是由于蟲體的形態(tài)具有可塑性。其次，當(dāng)蟲體寄生于異常宿主時(shí)使得人們對(duì)病原體的鑒定更為困難。歷史上，曾經(jīng)將棘球?qū)倌Ｊ椒N——細(xì)粒棘球絳蟲認(rèn)為是囊性棘球蚴病和泡型棘球蚴病的病原體。雖然每一個(gè)種都有著不盡相同的宿主和寄生蟲關(guān)系，但是它們之間無(wú)論在地理分布還是形態(tài)學(xué)等方面有交叉和重疊現(xiàn)象，這給種的準(zhǔn)確識(shí)別造成了困難。因而，種的確切鑒定還需要其它方法和手段。

二十世紀(jì)九十年代，隨著澳大利亞一研究小組應(yīng)用分子分類學(xué)分析方法才使人們對(duì)棘球絳蟲的分類和鑒定有了大的突破。研究人員通過(guò)對(duì)分離株樣品線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基1(Cytochromecoxidase subunit 1,cox1)和NADH脫氫酶亞基1(NADH dehydrogenase subunit 1,nad1)的基因片段的序列測(cè)定和分析，利用分子遺傳標(biāo)記特征成功將細(xì)粒棘球絳蟲不同蟲株進(jìn)行了基因分型，澄清了不同蟲株與基因型之間的確切關(guān)系，并且確定了棘球絳蟲不同種之間的差異[35]。隨后，更多的基因序列被用于棘球絳蟲蟲種鑒定與分子進(jìn)化關(guān)系分析，使種的識(shí)別成為現(xiàn)實(shí)，種水平上的分類成為可能。通過(guò)這些基因片段序列數(shù)據(jù)可成功將細(xì)粒棘球絳蟲G1-G3型定名為狹義種，G4定名為馬棘球絳蟲，G5定名為奧氏棘球絳蟲，G6-G10定名為加拿大棘球絳蟲。大約在同一時(shí)期，科學(xué)家們?cè)谖覈?guó)青藏高原發(fā)現(xiàn)了石渠棘球絳蟲，獅株被定名為獅棘球絳蟲，加之之前已定名的3種棘球絳蟲，共確立了棘球?qū)俳{蟲9個(gè)種的分類地位。

表1 棘球絳蟲9個(gè)有效種流行病學(xué)主要特征之間的比較

表1續(xù)

種名Species蟲株/基因型Genotype中間宿主Intermediate host終末宿主Final host地理分布Distribution人的病例Human Infection參考文獻(xiàn)References鹿株(G10)(Fennoscandian cervid strain)駝鹿(Moose)、馴鹿(Rein-deer)、馬鹿(Red deer)狼(Wolf)、犬(Canine)加拿大 (Canada)偶見(Rare)[29]獅棘球絳蟲(E. felidis)獅株(Lion strain)未知 (Un-known)獅 (Lion)非洲 (Africa)未報(bào)道(Not repor-ted yet)[30]多房棘球絳蟲(E.multilocu-laris)分離株變異及種內(nèi)變異較小,可分成歐洲、亞洲和美洲進(jìn)化支(Ge-netic variation of isolates and intraspecific variation within species being small; divided into different clades: Europe-an clade, Asian clade and A-merican clade )小型哺乳動(dòng)物(Small mam-mal)、家豬(Pig)、野豬(Wild boar)、猴(Monkey)、犬(Canine)狐貍(Fox)、犬(Canine)、貓(Cat)、狼(Wolf)、貉(Racoon dog)、土狼(效狼,Hyena)北半球 (The Northern Hemi-sphere)常見(Common)[31]石渠棘球絳蟲(E. shiquicus)未見報(bào)道 (Not reported yet)高原鼠兔(Plateau pi-ka)、田鼠(Hedgeshrew)藏狐(Tibetan fox)、犬(ca-nine) 中國(guó)青藏高原(Qinghai and Tibet Plateau, China)未報(bào)道(Not reported yet)[32]福氏棘球絳蟲(E. vogeli)未見報(bào)道(Not reported yet)小型哺乳動(dòng)物(Small mam-mals)、天竺鼠(Cavia porcel-lus)、刺鼠(Agouti)、松鼠(Aquirrel)叢林犬(藪犬,Bush dog)、家犬(Domestic dog)新熱帶區(qū) (Neotropical region)偶見(Rare)[33]少節(jié)棘球絳蟲(E.oligarthra)未見報(bào)道(Not reported yet)小型哺乳動(dòng)物(Small mam-mals)、天竺鼠 (Cavia porcel-lus)、刺鼠(Agouti)野生貓科動(dòng)物(The wild fe-lines)、美洲虎(Jaguar)、美洲豹(Leop-ard)、美洲獅(Cougar)、美洲山貓(Bob-cat)新熱帶區(qū)(Neotropical region)偶見(Rare)[34]

3 種系發(fā)生關(guān)系

DNA序列信息已成為種系發(fā)生分析的先決條件，其中線粒體DNA序列由于受到線粒體內(nèi)氧化環(huán)境的影響而容易發(fā)生突變，因此其進(jìn)化速率快，在構(gòu)建親緣關(guān)系相近物種的進(jìn)化樹時(shí)比使用核DNA序列更有優(yōu)勢(shì)[36]。大量線粒體基因(組)序列信息已經(jīng)為提高種系進(jìn)化樹的分辨率積累了重要信息(見表2)。棘球?qū)俳{蟲線粒體基因組核苷酸序列差異性比較結(jié)果見表3。

表2 棘球?qū)俳{蟲線粒體基因組信息匯總

注：*cox1基因3′末端注釋有疑問(wèn)。

Note: *The annotation of 3′ end ofcox1 gene is in doubt.

4 種系進(jìn)化史

棘球絳蟲具有獨(dú)特的繁殖方式：成蟲為雌雄同體，以自體受精為主；中絳期(幼蟲或者蚴)行無(wú)性繁殖。棘球絳蟲這種繁殖形式造就了它的生物多樣性，這種雙向發(fā)育和繁殖模式加速了遺傳一致性種群的形成[6]。一個(gè)突變體變?yōu)橐豢寺》N群的趨勢(shì)將

表3 棘球?qū)俳{蟲線粒體蛋白編碼基因核苷酸序列差異比較

影響棘球絳蟲種的形成。因此，棘球絳蟲成功自適應(yīng)突變體所需宿主在兩個(gè)發(fā)育階段——成蟲和幼蟲間的切換可能會(huì)出現(xiàn)，而宿主可能對(duì)變異體的成功形成起到適應(yīng)性選擇作用。

根據(jù)線粒體基因組12個(gè)蛋白編碼基因核苷酸序列第1位和第2位堿基構(gòu)建的棘球?qū)俳{蟲分子進(jìn)化樹見圖1(根據(jù)線粒體12個(gè)蛋白編碼基因核苷酸序列用MEGA5軟件的鄰接法繪制)，其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與Nakao等人構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生圖相似[6]。

圖1 棘球?qū)俳{蟲分子種系發(fā)生樹

分子進(jìn)化樹顯示：(1)E.oligarthra和E.vogeli位于進(jìn)化樹基部，這兩種棘球絳蟲分布于新熱帶區(qū)(Neotropical region)；(2)少節(jié)棘球絳蟲與棘球?qū)倨渌蓡T呈姊妹關(guān)系；(3)多房棘球絳蟲與石渠棘球絳蟲之間，細(xì)粒棘球絳蟲狹義種和獅棘球絳蟲之間，奧氏絳蟲和加拿大絳蟲之間分別呈姊妹關(guān)系；(4)馬棘球絳蟲與加拿大棘球絳蟲、奧氏棘球絳蟲、多房棘球絳蟲及石渠棘球絳蟲形成一進(jìn)化支；(5)加拿大棘球絳蟲G6-G10基因型之間親緣關(guān)系密切；(6)多房棘球絳蟲和石渠棘球絳蟲組成的節(jié)點(diǎn)與細(xì)粒棘球絳蟲G4-G10基因型組成的節(jié)點(diǎn)之間的自展檢驗(yàn)值比較低。

當(dāng)然，只用線粒體基因組數(shù)據(jù)構(gòu)建分子進(jìn)化樹也存在對(duì)真正進(jìn)化史誤解的風(fēng)險(xiǎn)，這是因?yàn)樾心感赃z傳的線粒體DNA并不與物種真實(shí)的進(jìn)化史相吻合或者相匹配[37]。為此，除用線粒體DNA作為進(jìn)化的分子標(biāo)記外，研究者還用多個(gè)核基因DNA序列分子標(biāo)記串聯(lián)后構(gòu)建了棘球絳蟲的分子進(jìn)化樹[43]。這些核基因DNA分子標(biāo)記包括elp(Ezrin-radixin-moesin-like protein，埃茲-根蛋白-膜突蛋白樣蛋白)、ef1α(Elongation factor 1 alpha，延伸因子1α)、pepck(Phosphoenolpyruvate carboxykinase，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶)、polδ(DNA polymerase delta，DNA 聚合酶δ)等[20]。結(jié)果表明，核基因DNA分子進(jìn)化拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)總體上與線粒體基因組序列構(gòu)建的進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相似，但是核基因DNA分子進(jìn)化樹的最顯著的特征是少節(jié)棘球絳蟲和伏氏棘球絳蟲不僅位于樹的基部，而且分布于新熱帶的這兩個(gè)種之間呈現(xiàn)姊妹關(guān)系。這種分子種系發(fā)生分析結(jié)果似乎可以得出一可信的假設(shè)：幾種貓科動(dòng)物作為少節(jié)棘球絳蟲的終末宿主，而藪犬(Bush dog，學(xué)名Speothosvenaticus)作為伏氏棘球絳蟲的終末宿主，這些食肉動(dòng)物作為外來(lái)“移民”源從北美洲，棘球絳蟲的祖先種顯然是隨著這些貓科動(dòng)物或者犬科動(dòng)物宿主侵入南美洲。化石記錄表明，除了浣熊外再?zèng)]有其它有胚盤的食肉動(dòng)物在南美洲一帶擴(kuò)張過(guò)。北美洲食肉動(dòng)物大擴(kuò)散好像發(fā)生在早更新世，它們進(jìn)化為南美洲本地食肉動(dòng)物種群。但是，最新的分子進(jìn)化研究表明，美洲本地新熱帶區(qū)貓科動(dòng)物的一支——虎貓屬(Leopardus)是更早時(shí)候從其它主要貓科譜系衍化來(lái)的，這意味著這些小型貓科動(dòng)物很可能在巴拿馬地峽出現(xiàn)前就侵入了南美洲。只不過(guò)，巴拿馬大陸橋的形成可能使得虎貓屬動(dòng)物物種的進(jìn)一步分化變得更為便利。正如這一例子所揭示的那樣，食肉動(dòng)物入侵新熱帶區(qū)的時(shí)間節(jié)點(diǎn)以及接下來(lái)發(fā)生的動(dòng)物區(qū)系變化對(duì)分析棘球絳蟲種系進(jìn)化至關(guān)重要。假設(shè)棘球絳蟲新熱帶區(qū)種的分化和食肉動(dòng)物的擴(kuò)張與巴拿馬大陸橋介入動(dòng)物遷徙相一致，將發(fā)生在約三百萬(wàn)年前的美洲動(dòng)物大交換作為棘球絳蟲核基因DNA分子進(jìn)化的關(guān)鍵時(shí)間校準(zhǔn)點(diǎn)，以新熱帶區(qū)的兩種棘球絳蟲最近的共同祖先存在時(shí)間定于三百萬(wàn)年前構(gòu)建分子鐘，那么這些推測(cè)會(huì)表明棘球絳蟲在第三紀(jì)中新世結(jié)束時(shí)(五百八十萬(wàn)年前)已經(jīng)開始分化。

棘球?qū)俳{蟲為單系群，在形態(tài)學(xué)、發(fā)育和遺傳學(xué)組成方面極其相似，關(guān)于它的祖先以及帶科絳蟲中棘球?qū)俳{蟲和帶屬(Taenia)中的內(nèi)鼬帶絳蟲(T.mustela)比較生態(tài)學(xué)、生理學(xué)和遺傳學(xué)關(guān)系的科學(xué)揭示將對(duì)嚴(yán)重危害人和動(dòng)物健康的棘球?qū)俳{蟲的進(jìn)化史的認(rèn)識(shí)至關(guān)重要。

5 小 結(jié)

棘球?qū)俳{蟲分子種系發(fā)生、分子分類學(xué)和分子進(jìn)化研究尚處于初始階段，研究方法和手段還不成熟，但是這方面工作的開展無(wú)疑會(huì)對(duì)揭示寄生蟲和宿主相互關(guān)系框架的創(chuàng)立起始動(dòng)和推動(dòng)作用，對(duì)棘球蚴病和其它帶科絳蟲蚴病的防控提供理論指導(dǎo)和奠定基礎(chǔ)。

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