大孔樹脂分離純化松潘烏頭總生物堿研究

王小芳， 張喜民， 鄧月婷， 盧 英， 吳秀琴， 賈繼禧

(甘肅隴神戎發(fā)藥業(yè)股份有限公司,甘肅 蘭州 730101)

松潘烏頭(AconitunsungpanenseHand-Mazz)[1]為毛茛科烏頭屬植物，主要分布在甘肅、青海、四川、陜西、寧夏、山西等地。別名火焰子、蔓烏藥、羊角七、藤烏藥。民間用于治療跌打損傷、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎引起的疼痛和紅腫等癥狀[2-5]。本課題組在前期對其化學(xué)成分及藥效學(xué)方面進(jìn)行了試驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)松潘烏頭的有效成分總生物堿，表現(xiàn)出較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛、抗炎作用。為了深入研究開發(fā)松潘烏頭的可利用價(jià)值，以富集確定有效部位為目的，本實(shí)驗(yàn)采用大孔樹脂對其總生物堿提取純化工藝進(jìn)行研究，提高其生物堿量，為下一步制劑研究以及新藥申報(bào)等方面的工作提供研究依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料 松潘烏頭(AconitunsungpanenseHand-Mazz) 采自甘肅天水，由甘肅林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院任繼文教授鑒定。

1.2 儀器及試劑 KQ-500M超聲波清洗儀(東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司)；TU-1901紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任有限公司)；YP502N電子天平(上海菁海儀器有限公司)；烏頭堿對照品(中國食品藥品檢定研究院)；氨水(分析純)；硫酸(分析純)；氫氧化鈉(分析純)；三氯甲烷(分析純)；乙醚(分析純)；溴甲酚綠(分析純)；冰醋酸(分析純)；無水硫酸鈉(分析純)；D101、AB-8、X-5、D-001(安徽三星樹脂公司)；NKA-9(天津波鴻樹脂科技有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 松潘烏頭總生物堿的制備 稱取粉碎后過60目篩的松潘烏頭藥材200 g，置提取設(shè)備中，用10%碳酸鈉溶液潤濕，拌勻，放置4 h，加入75%的乙醇1 000 mL，充分?jǐn)嚢瑁β蕿?00 W超聲提取[6]30 min，重復(fù)操作3次，合并提取液，減壓回收乙醇得松潘烏頭總生物堿浸膏。

2.2 總生物堿測定(酸性染料比色法)[7-8]

2.2.1 烏頭堿對照品溶液的制備 精密稱取烏頭堿對照品0.029 8 g，置100 mL量瓶中，用0.01 mol/L鹽酸溶解并稀釋至刻度，即得烏頭堿對照品質(zhì)量濃度為0.298 mg/mL。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取“2.1”項(xiàng)制備的松潘烏頭總生物堿浸膏2 g，置100 mL量瓶中用0.01 moL的鹽酸溶解并稀釋至刻度，即得松潘烏頭總生物堿質(zhì)量濃度為20 mg/mL。

2.2.3 測定波長的選擇 精密吸取烏頭堿對照品溶液及供試品溶液各1.0 mL，置于具塞試管中，加氨試液0.5 mL，用乙醚∶三氯甲烷(體積比3∶1)4 mL提取兩次，合并提取液，蒸干，殘留物加0.01 mol/L鹽酸1.0 mL溶解，加pH 3.05的醋酸鹽緩沖液5.0 mL與溴甲酚綠指示液2.0 mL，搖勻，再精密加人三氯甲烷8.0 mL，充分振搖，靜置，分取三氯甲烷層，加無水Na2SO4脫水后，以0.01 mol/L鹽酸同法作空白。分別在200～800 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果表明，烏頭堿對照品和供試品溶液在416 nm處均有最大吸收，故選擇416 nm為檢測波長。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對照品溶液0.1、0.25、0.5、0.75、1.0 mL，置于具塞試管中，再分別補(bǔ)加0.01 mol/L的鹽酸0.9、0.75、0.5、0.25、0 mL之后，按照波長選擇的方法，以0.01 mol/L鹽酸同法作空白在416 nm下測定吸光度。以烏頭堿對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.191 2x-0.008 8,r2=0.999 8，線性范圍為0.029 8～0.298 mg/mL。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密量取0.298 mg/mL烏頭堿對照品溶液1.0 mL，置于具塞試管中，參照“2.2.4”項(xiàng)下方法操作，于416 nm處測定吸光度，連續(xù)測定6次。結(jié)果RSD為0.73%，說明儀器所測數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批制備的松潘烏頭總生物堿浸膏6份，各2 g，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.4”項(xiàng)下方法操作，于416 nm處測定吸光度，結(jié)果RSD為0.89%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下制備的供試品溶液1.0 mL，按“2.2.4”項(xiàng)下方法操作，顯色后分別在0、5、15、25、35、45、55 min于416 nm處測定吸光度，RSD為0.75%。結(jié)果表明，該方法在55 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取6份“2.2.2”項(xiàng)下制備的供試品溶液各1.0 mL，分別精密加入1.0 mL烏頭堿對照品溶液(0.298 mg/mL)，混勻，比色法測定吸光度。根據(jù)回歸方程計(jì)算回收率。烏頭堿的平均回收率為99.8%，RSD為2.46%。

2.2.9 樣品的測定 定量取上柱后的洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸干，殘留物加定量的0.01 mol的鹽酸溶解，按上述烏頭堿對照品的處理方式進(jìn)行測定。

2.3 大孔樹脂純化松潘烏頭生物堿

2.3.1 大孔樹脂的預(yù)處理 用體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇將樹脂浸泡24 h，使其充分溶脹，然后用乙醇清洗至洗出液與水混合(體積比1∶5)無白色渾濁后，再用大量蒸餾水洗去乙醇，備用。

2.3.2 大孔樹脂的篩選 通過靜態(tài)吸附法對D101、X-5、AB-8、NKA-9及D-001型樹脂進(jìn)行篩選，確定純化松潘烏頭生物堿的樹脂類型[9]。具體操作如下：精密稱取10 g樹脂D101、X-5、AB-8、NKA-9及D-001，經(jīng)過預(yù)處理之后分別置于100 mL錐形瓶中，加入過量松潘烏頭生物堿提取液，室溫條件下振搖24 h，使之充分吸附。測定吸附后松潘烏頭生物堿提取液中總生物堿的量。將靜態(tài)吸附飽和的樹脂，加體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液，在室溫條件下振搖24 h，測定乙醇中生物堿的量。重復(fù)3次，根據(jù)測定的結(jié)果，計(jì)算各樹脂的平均靜態(tài)吸附率與解吸附率，結(jié)果見表1。

表1 樹脂的吸附率與洗脫率

由表1可見，大孔吸附樹脂D101的飽和吸附量及洗脫率均優(yōu)于其余樹脂，因此，選擇D101樹脂進(jìn)行工藝參數(shù)考察。

2.3.3 單因素試驗(yàn) 將預(yù)處理后的D101樹脂裝入D3.5 cm × 30 cm的玻璃柱中，樹脂填裝高度為20 cm，水洗至無醇味?？疾焐蠘右嘿|(zhì)量濃度、上樣液pH、洗脫液質(zhì)量濃度及洗脫液pH，對D101大孔樹脂吸附性能及洗脫參數(shù)的影響。

2.3.3.1 上樣液質(zhì)量濃度的考察 將5份定量的松潘烏頭總生物堿提取液分別稀釋成0.10、0.15、0.20、0.25、0.50 g/mL，以1.5 BV/h體積流量上樣，檢測采用酸性條件下與碘化鉍鉀反應(yīng)產(chǎn)生橘紅色沉淀泄漏；待吸附飽和之后測定吸附剩余液中總生物堿的量，重復(fù)3次，根據(jù)測定的結(jié)果，計(jì)算各質(zhì)量濃度下平均吸附量，結(jié)果見表2。

表2 松潘烏頭生物堿提取液質(zhì)量濃度對D101吸附量的影響

表2表明，隨著松潘烏頭生物堿提取液質(zhì)量濃度的增大，D101對松潘烏頭生物堿的吸附量逐漸增加，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.20 g/mL，D101對松潘烏頭生物堿的吸附量達(dá)到29.49 mg/g，此后質(zhì)量濃度增加，吸附量沒有顯著增加，說明質(zhì)量濃度為0.2 g/mL時(shí)，D101對松潘烏頭生物堿的吸附量已接近飽和。因此，在D101動(dòng)態(tài)吸附松潘烏頭生物堿的實(shí)驗(yàn)中，最佳質(zhì)量濃度為0.2 g/mL。

2.3.3.2 上樣液pH的考察 取3份等量的松潘烏頭總生物堿提取液，用氨水分別調(diào)pH于4、5、6之后定容，使其質(zhì)量濃度為0.20 g/mL，以1.5 BV/h體積流量上樣，檢測采用酸性條件下與碘化鉍鉀反應(yīng)產(chǎn)生橘紅色沉淀為泄漏；待吸附飽和之后測定吸附剩余液中總生物堿的量。重復(fù)3次，根據(jù)測定的結(jié)果，計(jì)算不同上樣液pH下平均吸附量，結(jié)果見表3。

表3 松潘烏頭生物堿提取液pH對D101吸附量的影響

表3表明，松潘烏頭總生物堿提取液的pH為5時(shí)，D101對松潘烏頭生物堿的吸附量達(dá)到最高30.12 mg/g，所以本實(shí)驗(yàn)選擇總生物堿提取液的pH為5時(shí)上樣。

2.3.3.3 洗脫液pH的考察 取4份0.2 g/mL、pH5的松潘烏頭總生物堿提取液，分別以1.5 BV/h體積流量上樣，檢測采用酸性條件下與碘化鉍鉀反應(yīng)產(chǎn)生橘紅色沉淀為泄漏；待吸附飽和之后，用蒸餾水以2 BV/h的體積流量對雜質(zhì)進(jìn)行洗脫，再分別用pH為4、5、6、7，體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇以2 BV/h的體積流量對總生物堿進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，測定洗脫液中總生物堿的量。重復(fù)3次，計(jì)算其平均值，結(jié)果見表4。

表4 洗脫液pH對生物堿純化率的影響

表4表明，洗脫液pH從4增加到6，洗脫液中總生物堿的量也隨之增大；而pH從6增加到7，洗脫液中總生物堿的量反之降低；隨著pH的變化，洗脫率沒有明顯的變化；因此，此實(shí)驗(yàn)選擇洗脫液pH為6進(jìn)行洗脫。

2.3.3.4 洗脫液體積分?jǐn)?shù)的考察 取5份0.2 g/mL、pH5的松潘烏頭總生物堿提取液，分別以1.5 BV/h體積流量上樣，檢測采用酸性條件下與碘化鉍鉀反應(yīng)產(chǎn)生橘紅色沉淀為泄漏；待吸附飽和之后用5 BV的蒸餾水以2 BV/h的體積流量對雜質(zhì)進(jìn)行洗脫，再用pH為6、體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、75%、95%的乙醇以2 BV/h的體積流量對總生物堿進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，測定洗脫液中總生物堿的量。平行3組，計(jì)算平均值，結(jié)果如下表所示：

表5 洗脫液體積分?jǐn)?shù)對生物堿純化率的影響

表5表明，體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇洗脫液中總生物堿的量較高，而40%、50%、60%、95%的洗脫液中總生物堿含量相差不大；洗脫率隨著乙醇洗脫液體積分?jǐn)?shù)的增加而增大，故確定洗脫液的體積分?jǐn)?shù)為75%。

2.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)單因索試驗(yàn)結(jié)果，選取上樣液pH、上樣液質(zhì)量濃度、乙醇體積分?jǐn)?shù)等3個(gè)因素進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表6。

表6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)法因素和水平

2.3.4.2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果 結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行BoX-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用Design-Expert 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，建立數(shù)學(xué)模型，并獲得大孔樹脂D101純化松潘烏頭總生物堿工藝的最佳條件，響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果見表7。

2.3.4.3 模型的建立及其顯著性檢驗(yàn) 利用Design-Expert 7.0 軟件對表7試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到生物堿量(Y)對上樣液pH(A)、上樣液質(zhì)量濃度(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)的二次多項(xiàng)回歸模型為：

Y=222.96-4.43A-2.57B+0.45C-5.64AB+5.92AC-0.68BC-31.52A2-13.97B2-17.87C2

對該模型方程求一階偏導(dǎo)數(shù)等于零，求出最佳條件為：上樣液pH為5.0、上樣液質(zhì)量濃度為0.2 g/mL、洗脫液乙醇的體積分?jǐn)?shù)為75%。該回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表8。

根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)知識對方差分析表進(jìn)行分析，模型的P<0.000 1，模型失擬項(xiàng)(P=0.125 5)不顯著，說明可以用該模型來分析和預(yù)測大孔樹脂D101純化松潘烏頭總生物堿的工藝結(jié)果。從回歸方程模型因變量的方差分析可知：模型的一次項(xiàng)A差異顯著；交叉項(xiàng)AB、AC差異顯著；二次項(xiàng)A2、B2、C2差異極顯著，說明所選因素與響應(yīng)值之間不是簡單的線性關(guān)系。依據(jù)回歸方程的系數(shù)值和方差分析表可知，在響應(yīng)面的試驗(yàn)范圍內(nèi)因素的主效應(yīng)關(guān)系為：上樣液pH>上樣液質(zhì)量濃度>洗脫液體積分?jǐn)?shù)。

表7 響應(yīng)面方案及試驗(yàn)結(jié)果

表8 回歸模型方差分析

2.3.4.4 響應(yīng)曲面分析 由多元回歸方程可以得到不同因素對成分量影響的響應(yīng)面及其等高線圖。等高線圖表示在同一橢圓形的曲線上，生物堿的量是相同的。在橢圓形區(qū)域中心，生物堿量最高，由中心向邊緣逐漸降低。響應(yīng)曲面坡度越陡峭，表明響應(yīng)值對于操作條件的改變非常敏感，而曲面坡度相對平緩，表明操作條件的改變對響應(yīng)值的改變會比較小。根據(jù)上述性質(zhì)可以看出：上樣液質(zhì)量濃度與上樣液pH，上樣液pH與洗脫液體積分?jǐn)?shù)存在明顯的交互效應(yīng)，而上樣液質(zhì)量濃度與洗脫液體積分?jǐn)?shù)交互效應(yīng)不明顯。見圖1～圖3。

2.3.4.5 最優(yōu)工藝條件求取與驗(yàn)證 通過Design-Expert 7.0軟件求得大孔樹脂D101純化松潘烏頭總生物堿的最佳工藝條件如下：上樣液質(zhì)量濃度為0.2 g/mL，上樣液pH為5.0，洗脫液體積分?jǐn)?shù)為75%，在此條件下進(jìn)行6次驗(yàn)證試驗(yàn)，則松潘烏頭總生物堿的平均含有量為223 mg/g，RSD為1.78%。表明實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

圖1 上樣液質(zhì)量濃度和上樣液pH對純化率的影響

圖2 上樣液pH和洗脫液體積分?jǐn)?shù)對純化率的影響

圖3 上樣液質(zhì)量濃度和洗脫液體積分?jǐn)?shù)對純化率的影響

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用大孔吸附樹脂D101，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面回歸分析法，達(dá)到了純化松潘烏頭總生物堿的工藝目的?？疾炝松蠘右嘿|(zhì)量濃度、上樣液pH值、洗脫液體積分?jǐn)?shù)和洗脫液pH對大孔吸附樹脂D101純化松潘烏頭總生物堿的影響，響應(yīng)面法研究表明大孔吸附樹脂D101純化松潘烏頭總生物堿的最佳工藝條件為：松潘烏頭提取液質(zhì)量濃度為0.2 g/mL，pH為5.0，乙醇洗脫體積分?jǐn)?shù)為75%，在此條件下松潘烏頭含有量為22%，工藝簡便，參數(shù)穩(wěn)定可靠，因此，大孔吸附樹脂D101適宜于松潘烏頭總生物堿的分離純化，通過中試研究可應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，也為相關(guān)研究的進(jìn)一步開展提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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