離子對色譜法同時測定益母草片中鹽酸水蘇堿、鹽酸益母草堿

符滇海， 馮 葉， 劉秋雨， 盧蓉娜

(佛山市順德區(qū)藥品檢驗所，廣東 順德 528300)

益母草片為益母草制成的片劑，功能主治活血調(diào)經(jīng)，用于月經(jīng)量少。目前其質量標準[1]以鹽酸水蘇堿為定量指標，用重量法測定其含有量。該方法分析步驟多，反應時間長，試驗條件嚴格，大大影響了該檢驗速度和準確性。除此之外，也有采用高效液相色譜法[2-5]，但由于保留時間過短、色譜柱不通用或峰形不理想，加之鹽酸水蘇堿具有的特殊的分子結構，不適用于益母草片的定量測定。本方法采用C18柱梯度洗脫同時測定鹽酸水蘇堿和鹽酸益母草堿，使用普通試劑，采用獨特的樣品預處理方法，克服了現(xiàn)有質量標準的弱點。

1 儀器與試藥

Dionex U3000高效色譜儀，二極管陣列檢測器；昆山KQ-300DA型超聲振蕩器(功率300 W,頻率40 kHz),鹽酸水蘇堿化學對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110712-201010，純度為99.9%)，鹽酸益母草堿化學對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號111823-201202，純度為94.7%)，益母草片(廣東環(huán)球制藥有限公司，批號分別為101101、110903、110904)。陰性輔料空白(廣東環(huán)球制藥有限公司提供)乙腈為色譜純，十二烷基硫酸鈉(化學純)、戊烷磺酸鈉、己烷磺酸鈉、庚烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉(以上4種離子對試劑均為色譜專用)、磷酸為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動相為0.010 mol/L辛烷磺酸鈉溶液(用磷酸溶液調(diào)至pH至2.0)-乙腈，梯度洗脫(0～10 min，10%乙腈；10～15 min,10%～24%乙腈；15～25 min,24%乙腈；35～40 min,4%～10%乙腈,40～50 min,10%乙腈)；檢測波長為192 nm(鹽酸水蘇堿)，218 nm(鹽酸益母草堿)；體積流量為1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量10 μL。

2.2 供試品溶液制備 取10片益母草片，除去包衣，精密稱定，研細，精密稱定1.972 8 g(約相當于鹽酸水蘇堿45 mg)，置100 mL量瓶中，70%乙醇約70 mL，超聲45 min，放冷，加70%乙醇至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，加在酸性氧化鋁柱(200～300目，5 g，內(nèi)徑為1.5 cm，濕法裝柱)上，用水20 mL洗脫，收集洗脫液于蒸發(fā)皿中，置水浴上蒸干，用70%乙醇溶液溶解并轉移至5 mL的量瓶中，定容，搖勻，濾過，即得。

2.3 對照品制備 取鹽酸水蘇堿、鹽酸益母草堿對照品適量，精密稱定，加70%乙醇溶解，分別制成每1 mL約含0.25 mg、7.0 μg和0.35 mg、9.0 μg的兩份混和對照品溶液。用兩點校正法計算。

2.4 線性關系 精密稱取鹽酸水蘇堿對照品適量，用70%乙醇溶解得到質量濃度為914.5 μg/mL貯備液，分取制得18.29、36.57、91.43、182.86、274.30、548.58、914.30 μg/mL的對照品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進行測定。在上述色譜條件下分別進樣10 μL，以質量濃度(x)為自變量，峰面積(y)為因變量，得到回歸方程為y=1.720 3x+3.213，r=0.999 96(n=7)。結果鹽酸水蘇堿在18.29～914.30 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系。

精密稱取鹽酸益母草堿對照品適量，用70%乙醇溶解得到質量濃度為32.26 μg/mL貯備液，分取制得0.645 3、1.613、3.226、6.453、12.91、19.36、32.26 μg/mL的對照品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進行測定。在上述色譜條件下分別進樣10 μL，以質量濃度為自變量，峰面積為因變量，得到回歸方程y=44.86x-4.70，r=0.999 97(n=7)結果鹽酸益母草堿在0.645 3～32.26 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗 取“2.3”項下的對照品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進行測定，重復測定6次，按峰面積及出峰時間計算精密度，鹽酸水蘇堿峰面積的RSD為0.2%，保留時間的RSD為0.04%，鹽酸益母草堿峰面積的RSD為0.3%，保留時間的RSD為0.04%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一批號供試品溶液置于室溫，分別于0、2、4、6、8、14 h內(nèi)按“2.1”項下的色譜條件進行測定。以峰面積計算鹽酸水蘇堿和鹽酸益母草堿成分相對標準偏差RSD分別為0.7%、0.6%，表明供試品溶液在14 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗 精密稱取同一批號(廣東環(huán)球制藥有限公司，批號110904，含鹽酸水蘇堿15 mg/片)分別按“2.2”項下的方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進行測定，鹽酸水蘇堿為標示量59.6%，RSD為0.9%。鹽酸益母草堿0.288 mg/片，RSD為0.5%。

2.8 回收率試驗 精密稱取已知含有量的樣品(廣東環(huán)球制藥有限公司，批號110904，含鹽酸水蘇堿15 mg/片)9份，折合為鹽酸水蘇堿和鹽酸益母草堿的量，置25 mL的量瓶中，并精密加入不同體積的同一質量濃度的對照品溶液，按“2.2”項下的方法處理，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，制成不同的供試品溶液。按“2.1”項下的色譜條件進行測定，結果鹽酸水蘇堿和鹽酸益母草堿的平均回收率分別為99.7%(RSD 1.4%)、98.2%(RSD 0.7%)。見表1、2。

表1 鹽酸水蘇堿加樣回收率試驗

表2 鹽酸益母草堿加樣回收率試驗

2.9 樣品測定 取樣品(廣東環(huán)球制藥有限公司，批號110904：含鹽酸水蘇堿15 mg/片)，按“2.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進行測定，以外標法計算鹽酸水蘇堿的量。色譜圖見圖1、圖2。

圖1 鹽酸水蘇堿譜圖(192 nm)

圖2 鹽酸益母草堿色譜圖(218 nm)

用同樣的方法對該品種項下的3個批次(101101，110903，110904)樣品進行了測定。結果鹽酸水蘇堿分別為標示量65.1%(n=3,RSD為0.9%)、58.2%(n=3,RSD為0.7%)、59.6%(n=6,RSD為0.9%)；鹽酸益母草堿分別為0.278 mg/片(101101)(n=3,RSD為0.4%)、0.283 mg/片(110903)(n=3,RSD為0.5%)、0.288 mg/片(110904)(n=6,RSD為0.5%)。而用國家標準方法[1]測定得鹽酸水蘇堿的百分標示量分別為100.8%(101101)、98.3%(110903)和98.2%(110904)(該數(shù)據(jù)由廣東環(huán)球制藥有限公司提供)(標準規(guī)定，每片含鹽酸水蘇堿(C7H13NO2·HCl)應為標示量的90.0～110.0%)。由此可見，本方法與國家藥品標準方法相比，測定結果有較大的出入。

3 討論

3.1 流動相離子對試劑的選擇 將十二烷基硫酸鈉、戊烷磺酸鈉、己烷磺酸鈉、庚烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉配成相同摩爾濃度的離子對溶液，在相同p H2的條件下，按相同流動相比例進樣，記錄色譜圖。結果發(fā)現(xiàn)：所有離子對試劑都能使樣品出現(xiàn)色譜峰戊烷磺酸鈉、己烷磺酸鈉作為離子對試劑，鹽酸水蘇堿保留時間過早；十二烷基硫酸鈉在此流動相比例下不能完全溶解，且過濾后的流動相保留時間過長，峰形拖尾；辛烷磺酸鈉較庚烷磺酸鈉保留時間較長，有利于流動性比例的調(diào)整。且辛烷磺酸鈉作為流動相基線較穩(wěn)，空白進樣在主峰相應的位置上無干擾；當水系流動相中辛烷磺酸鈉的濃度為10 mmol/L時，鹽酸水蘇堿色譜峰的理論塔板數(shù)和對稱性較理想。且該色譜條件與《中國藥典》2010年版[2]收載的鹽酸益母草堿方法相近，所以通過梯度洗脫可完成鹽酸水蘇堿和鹽酸益母草堿的同時測定，效果良好。

3.2 流動相的pH值選擇 以10 mmol/L辛烷磺酸鈉溶液-乙腈(90∶10)為流動相，將水系和有機系混合后，用磷酸調(diào)pH，考察了pH從5.0～2.0對鹽酸水蘇堿色譜圖的色譜行為的影響，隨著pH的降低，保留時間也隨著增加，在pH約為2時，保留時間變得穩(wěn)定。結果發(fā)現(xiàn)，當pH在2時，在此條件下，能很好地滿足分析要求。

3.3 樣品的制備 我們參考了《中國藥典》[2]的提取方法并結合了藥品的制備工藝，采用70%乙醇為提取溶劑，和原標準中以0.1 moL/L鹽酸提取效果一樣，超聲提取30 min與回流提取相同時間效果也一致，且濃度不再增加，因此采取提取時間為45 min比較合適。采用氧化鋁過柱，以水為洗脫液，鹽酸水蘇堿、鹽酸益母草堿對照品溶液無損失，樣品的回收率均很高，且能去除大部分干擾雜質。試驗發(fā)現(xiàn)，使用酸性氧化鋁去除雜質效果最佳。

3.4 方法耐用性考察 對不同廠牌型號的色譜柱進行了考察，其中有Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、phnomenex Luna 5 μm C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)、Syncronis C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，均能得到柱效高，對稱性較好的色譜圖，且峰面積基本一致。表明本方法通用性、耐用性、重復性均良好。

3.5 測定結果討論 該方法與國家標準方法[1]測定存在較大的出入。究其原因，在國家標準中使用的與鹽酸水蘇堿起沉淀反應的試劑硫氰酸鉻銨溶液，可能與藥品中的其他物質也產(chǎn)生的沉淀反應，致使其比用高效液相法測得的值高出許多。同時還考察了按國家標準方法(10片置50 mL的量瓶中)與本實驗“2.2”項供試品制備進行了比較，發(fā)現(xiàn)用本方法測得的含有量結果基本一致。說明國家標準以鹽酸水蘇堿作為質量指標存在較大誤差。

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