付 強(qiáng) 莫 玲 王 艷 苗立中 （山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 256600）

兔病毒性出血癥（rabbit hemorrhagic disease，RHD），俗稱“兔瘟”，是由兔出血癥病毒引起的一種急性、敗血性和毀滅性的傳染病，給養(yǎng)兔業(yè)帶來巨大損失。在該病檢測與防控方面，國內(nèi)外研究者做了許多努力并取得了一定的成果。兔瘟是對養(yǎng)兔業(yè)造成最大危害的一種重要病毒性傳染病，具有高度接觸性致死性。其病原體是兔出血癥病毒(rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV) ， 屬 于 杯 狀 病 毒 科(Caliciviridae) 兔 病 毒 屬(Lagovirus)。1984年該病首次在中國發(fā)現(xiàn)，在世界范圍內(nèi)迅速蔓延，所有的致病菌株只有一個(gè)血清型，RHD導(dǎo)致家兔和野兔的高死亡率，個(gè)體感染后多在在48～72h死亡。病理變化為呼吸急促、呼吸系統(tǒng)出血、實(shí)質(zhì)器官瘀血腫大和點(diǎn)狀出血以及肝臟點(diǎn)狀壞死。雖然細(xì)胞培養(yǎng)至今仍未實(shí)現(xiàn)，但經(jīng)過許多科研工作者的不懈努力，還是取得諸多成績，本文對近幾年來有關(guān)兔病毒性出血癥診斷、疫苗研制方面的取得的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 病原特性

（1）RHDV呈球型，直徑30nm左右，無囊膜，核衣殼呈20面體對稱，由32個(gè)顆粒組成，在核衣殼上整齊地排列著中空的杯狀結(jié)構(gòu)。RHDV的基因組為一條單股正鏈的RNA分子，由約7437個(gè)核苷酸組成。基因組含有2個(gè)開放閱讀筐架(ORF)：其中ORFl 編碼病毒的衣殼蛋白VP60。VP60能夠自聚合形成病毒樣顆粒(VLPs)，在病毒誘導(dǎo)機(jī)體的免疫保護(hù)應(yīng)答起主要作用。RHDV是侵害多種組織細(xì)胞的泛嗜性病毒，但主侵器官是肝臟，主要靶細(xì)胞是肝細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞。RHDV侵入細(xì)胞后先在細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制裝配，然后再向胞質(zhì)及胞外擴(kuò)散。（2）根據(jù)RHDV能夠快速凝集人“O”型紅細(xì)胞的特性，可采用微量法和玻板法檢測。與ELISA比較，HA出現(xiàn)8%的假陽性或假陰性，假陽性可能是由于存在非特異性血凝因子，假陰性可能是由于病毒粒子衣殼蛋白降解或抑制性抗體所致。HA對可疑病例進(jìn)行診斷時(shí)，特別在HA試驗(yàn)出現(xiàn)陰性結(jié)果時(shí)，應(yīng)結(jié)合臨床表現(xiàn)和其它實(shí)驗(yàn)室檢測方法做綜合判定。血凝試驗(yàn)不適合于污染疫苗中RHDV的檢測[1]，由于低血凝活性或無血凝性毒株的存在[2,3]，血凝試驗(yàn)將逐漸被ELISA、RT-PCR等方法所取代。

2 診斷方法進(jìn)展

2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法之一，董婷等[4]采用3種特異性抗體，形成了“多克隆兔血清-抗原蛋白-小鼠腹水單抗-羊抗鼠IgG-HRP抗體”的雙夾心結(jié)構(gòu)，對52份待檢兔肝臟樣品的檢測結(jié)果顯示：雙夾心ELISA和HA 試驗(yàn)的陽性檢出率分別為82.7%(43/52)和75.0% (39/52)，雙夾心ELISA與HA試驗(yàn)的符合率為90.7%，其敏感性為HA的100倍。用不同批次包被的酶標(biāo)板重復(fù)檢測已知樣品顯示出良好的重復(fù)性。祖立闖等[5]研制的間接ELISA抗體檢測試劑盒，當(dāng)陽性對照血清稀釋至12800倍時(shí)，檢測結(jié)果仍為陽性，具有較好的敏感性。秦海斌等[6]用RHDV單克隆抗體包被酶標(biāo)板，以兔多克隆抗體作為夾心抗體，建立RHDV抗原捕獲ELISA檢測方法。可特異性地檢測出兔肝臟病料中的RHDV，純化病毒的最低檢出量為26μg/L。對已知陽性樣品的檢測顯示，捕獲ELISA檢測的病毒滴度是HA試驗(yàn)的3～13倍。用不同批次包被的酶標(biāo)板重復(fù)檢測已知樣品顯示出良好的重復(fù)性。

2.2 分子生物學(xué)檢測技術(shù)

2.2.1 RT-PCR檢測RHDV 常規(guī)RT-PCR檢測RHDV報(bào)道很多[7-9]，肖躍強(qiáng)等[7]根據(jù)GenBank中公布的RHDV全基因組序列，建立RT-PCR檢測方法，可以擴(kuò)增102拷貝以上的模板，對兔輪狀病毒與水泡性口炎病毒檢測結(jié)果均為陰性；臨床應(yīng)用對比實(shí)驗(yàn)顯示，與HA檢測相比，該方法檢出陽性率由66.7%提升至77.8%。周智君等[10]采用套式PCR 檢測方法對12 份RHD 樣本進(jìn)行檢測，檢出率為100%。王景儒等[11]建立的檢測RHDV的巢式RT-PCR，可以準(zhǔn)確快速檢測出極低含量的RHDV，對兔輪狀病毒、仙臺(tái)病毒、健康兔肝臟組織的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。熒光定量PCR技術(shù)，是一種新型的核酸檢測技術(shù)，在臨床診斷中已經(jīng)用于細(xì)菌、病毒及遺傳性疾病的檢測，具有極大的應(yīng)用價(jià)值。肖躍強(qiáng)等[12]建立了SYBR GreenⅠ熒光染料real-time RT-PCR檢測方法，該方法可檢出101以上拷貝數(shù)的模板，實(shí)際應(yīng)用結(jié)果顯示，該方法對疑似RHDV病料檢測的陽性率為74.8%，而普通RT-PCR方法檢測的陽性率為65.5%。波蘭學(xué)者P.Niedzwiedzka-Rystwej等[13]建立了類似的RHDV檢測方法，對來自歐洲不同區(qū)域的具有不同毒力的17個(gè)不同毒株檢測，研究結(jié)果表明實(shí)時(shí)PCR是診斷RHDV的有效方法，無需考慮毒株的特性。

2.2.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAmP) 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法是一種全新的核酸擴(kuò)增方法，具有簡單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標(biāo)上能媲美甚至優(yōu)于PCR技術(shù)，不依賴任何專門的儀器設(shè)備實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測，檢測成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR。原冬偉等[14]根據(jù)GenBank中的中國RHDV分離株VP60基因保守序列設(shè)計(jì)合成了內(nèi)、外2對引物，在BstDNA聚合酶的作用下完成等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)，對反應(yīng)條件逐一優(yōu)化，并對臨床樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，該方法簡便、快速、特異性好，靈敏性較常規(guī)RT-PCR高100倍。該方法可同時(shí)擴(kuò)增7株RHDV中國分離株，說明其對檢測國內(nèi)RHDV分離株的有效性。對15份臨床樣品的檢測結(jié)果顯示，LAmP陽性檢出率達(dá)80%，RT-PCR檢測陽性率為60%。由于LAmP擴(kuò)增是鏈置換合成，靶序列長度最好在300bp以內(nèi)，由于靈敏度高，極易受到污染而產(chǎn)生假陽性結(jié)果。故要特別注意嚴(yán)謹(jǐn)操作。

2.3 膠體金免疫層析

膠體金免疫層析(Gold Immuno-chromatographic Assay, GICA)是一種將膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫檢測技術(shù)和層析分析技術(shù)等多種方法有機(jī)結(jié)合在一起的固相標(biāo)記免疫檢測技術(shù)。蔡少平等[15]用膠體金標(biāo)記純化的RHDV多克隆抗體，以桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組RHDV-VP60蛋白為免疫原制備RHDV的單克隆抗體（mcAb，簡稱單抗）A3C，將RHDV mcAb和羊抗兔IgG抗體包被在硝酸纖維素膜上，分別作為檢測線和質(zhì)控線，經(jīng)條件優(yōu)化研制成RHDV免疫膠體金試紙條。該試紙條可以檢出紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（HA）效價(jià)為1:10的RHDV懸液，即HA檢測為陰性的樣品，該試紙條檢測為陽性，其敏感性高于HA；特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該試紙條不與家兔其他常見病菌發(fā)生交叉反應(yīng)。應(yīng)用該試紙條對127份疑似兔出血癥家兔肝臟樣品進(jìn)行初步檢測，同時(shí)用HA做平行試驗(yàn)，陽性符合率為100%。

3 疫苗研制進(jìn)展

在兔瘟的防治中，目前廣泛應(yīng)用的兔病毒性出血癥商品疫苗，是通過活兔攻毒制備的臟器組織滅活苗，采取皮下或肌肉注射接種，具有良好的免疫效果，在接種后2周左右，HI抗體滴度可達(dá)211以上，免疫期可達(dá)1年以上。但該途徑存在因攻毒過程控制不嚴(yán)或病毒滅活不徹底而散毒，體內(nèi)的副反應(yīng)多，抗原量難以把握，生物安全性低及不符合動(dòng)物福利要求等諸多缺點(diǎn)。細(xì)胞滅活苗制備工藝簡單，培養(yǎng)方便快捷，病毒可定量，成本低廉，安全，高效，不存在散毒的危險(xiǎn)，但至今還沒有一種能夠使其長期穩(wěn)定傳代的細(xì)胞，也無細(xì)胞培養(yǎng)滅活苗問世。鑒于RHDV比較單一的血清型，衣殼VP60蛋白在誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)中的重要作用及其相對比較保守的氨基酸序列為基因工程苗的研制提供了方便。近年來，RHDV新型疫苗的研究正是以病毒衣殼蛋白VP60為基礎(chǔ)。目前國內(nèi)外學(xué)者已在大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞、腺病毒以及植物等多種表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)了VP60蛋白[16]，所有表達(dá)產(chǎn)物都可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)抵抗RHDV的致死攻擊。但從目前RHDV基因工程疫苗的研究來看，仍然存在一些問題比如：不可溶性及免疫效果相對較差的缺點(diǎn)，生物體的安全以及生產(chǎn)成本的問題。而DNA疫苗和“自殺性”DNA疫苗，可彌補(bǔ)此類缺陷，有望為疫苗研制開辟新的途徑。原冬偉等[17]制備DNA疫苗pcDNA-VP60，通過間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)和免疫印跡試驗(yàn)（Western blot）可檢測出表達(dá)的重組衣殼蛋白VP60，通過電鏡觀察到VP60蛋白可自組裝形成病毒樣顆粒(VLPs)，具有似于自然顆粒的形態(tài)。在疫苗效力檢驗(yàn)中，用DNA疫苗免疫的兔子和商用滅活疫苗一樣，均得到全部保護(hù)。 Cheng Y等[18]使用SFV復(fù)制子研究兔瘟“自殺性”DNA疫苗并評估疫苗預(yù)防RHDV的效力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明保護(hù)率達(dá)到100%。Qiu L等[19]使用減毒沙門氏菌作為載體通過口服方式遞送DNA疫苗來預(yù)防RHDV，DNA疫苗質(zhì)粒pcDNA3.1-VP60，其編碼病毒衣殼蛋白VP60，被轉(zhuǎn)錄到減毒沙門氏菌SL7207中。獲得重組菌SL/pcDNA3.1-VP60，通過口服免疫兔子。成功的遞送DNA質(zhì)粒，通過RT-PCR反應(yīng)在兔腸中檢測到VP60蛋白，此外，通過ELISA檢測可誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答免疫，兔子攻毒后得到良好的保護(hù)。

4 結(jié)論

目前兔病毒性出血癥沒有特效藥，對于此病防控要擺在首位，找到一種方便、靈敏的檢測方法是兔場和基層科研人員的迫切需要的，對于兔出血癥病毒的現(xiàn)場診斷，試劑盒、試紙條作為一種快速、靈敏、特異的檢測方法，具有很好的臨床應(yīng)用前景。在疫苗研發(fā)方面，期望有基因工程類疫苗商業(yè)化，核酸疫苗和“自殺性”核酸疫苗，作為“第三代”疫苗，還需要盡快解決產(chǎn)業(yè)化等一系列問題。

[1]高金源, 陳曉春, 韓玉玲等.豬瘟活疫苗(脾淋源)污染外源性兔出血癥病毒的檢測與啟示[J].中國獸藥雜志, 2011, 45(12): 16-18.

[2]肖躍強(qiáng), 張文倩, 吳信明等.無血凝性兔出血癥病毒VP60蛋白分子特性的分析及其在大腸桿菌內(nèi)的高效表達(dá)[J].中國獸醫(yī)科學(xué), 2012, 42(10): 1017-1023.

[3]N.-R.Paulina and D.Wies?aw.Apoptosis of peripheral blood leukocytes from rabbits infected with non-haemagglutinating strains of rabbit haemorrhagic disease virus (RHDV)[J].Veterinary Immunology and Immunopathology, 2012, 149(1-2): 54-57.

[4]董婷, 王芳, 熊富強(qiáng)等.兔出血癥病毒雙夾心ELISA檢測方法的建立[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2011, 27(3): 571-576.

[5]祖立闖, 沈志強(qiáng), 王金良.兔病毒性出血癥病毒間接ELISA抗體檢測試劑盒的研制及其臨床應(yīng)用[J].中國養(yǎng)兔, 2012(10): 7-11.

[6]秦海斌.兔出血癥病毒抗原捕獲ELISA檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2008, 28(1): 28-31.

[7]肖躍強(qiáng), 劉吉山, 楊慧等.兔出血癥病毒RT-PCR檢測方法的建立與應(yīng)用[J].中國動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào), 2014, 22(3): 83-86.

[8]程漢, 曹軍平, 包祥嘉.兔出血癥病毒RT-PCR檢測方法的建立及 臨床應(yīng)用[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 41(4): 191-193.

[9]王印, 楊澤曉, 韓雪清等.兔出血癥病毒與歐洲野兔綜合征病毒復(fù)合RT-PCR檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學(xué), 2011, 41(11): 1165-1170.

[10]周智君, 陳軍, 俞遠(yuǎn)京等.兔出血癥病毒套式PCR檢測方法的建立[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2006, 32(3): 261-263.

[11]王景儒.兔病毒性出血癥病毒巢式RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J].中國畜牧獸醫(yī), 2013, 40(5): 86-89.

[12]肖躍強(qiáng), 謝金文, 徐二丹等.兔出血癥病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測方法的建立[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2013, 34(12): 69-73.

[13]P.Niedzwiedzka-Rystwej, B.Hukowska-Szematowicz, J.Dzialo, et al.Real time PCR detection of rabbit haemorrhagic disease virus in rabbits infected with different European strains of RHDV[J].Pol J Vet Sci, 2013, 16(1): 39-43.

[14]原冬偉, 劉家森, 郭東春等.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在兔出血癥病毒檢測中的應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)科學(xué), 2013, 43(4): 390-395.

[15]蔡少平, 王芳, 賈華敏等.兔出血癥病毒膠體金免疫層析試紙條診斷方法的建立及初步應(yīng)用[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2012, 43(11): 1795-1801.

[16]鄭艷利, 王開, 馬紅霞等.兔病毒性出血癥疫苗研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2013, 34(3): 95-100.

[17]D.Yuan, L.Qu, J.Liu, et al.DNA vaccination with a gene encoding VP60 elicited protective immunity against rabbit hemorrhagic disease virus[J].Veterinary microbiology, 2013, 164(1): 1-8.

[18]Y.Cheng, Z.Chen, C.Li, et al.Protective immune responses in rabbits induced by a suicidal DNA vaccine of the VP60 gene of rabbit hemorrhagic disease virus[J].Antiviral Res, 2013, 97(3): 227-231.

[19]L.Qiu, X.Wang, H.Hao, et al.Oral administration of attenuated Salmonella typhimurium containing a DNA vaccine against rabbit haemorrhagic disease[J].J Virol methods, 2013, 188(1-2): 108-113.