辛林偉，王梨明，唐際存，李朝旭，李 強(qiáng)

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西桂林540001)

周圍神經(jīng)組織特有的再生機(jī)制可以使神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子向?qū)Ч軆?nèi)聚集，為神經(jīng)創(chuàng)造良好的再生環(huán)境［1～3］。搭建周圍神經(jīng)組織的主要細(xì)胞是雪旺細(xì)胞(SCs)，它是周圍神經(jīng)組織特有的膠質(zhì)細(xì)胞。正常SCs具有相當(dāng)高的穩(wěn)定性，但當(dāng)周圍神經(jīng)受損時(shí)，SCs可大量分泌多種內(nèi)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子［4，5］，如神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)等，而這些因子是創(chuàng)立和維持周圍神經(jīng)組織再生的主要活性物質(zhì)，但外源性NGF對(duì)SCs的影響報(bào)道較少。為此，我們觀察了外源性NGF對(duì)SCs中核轉(zhuǎn)錄因子 κB(NF-κB)mRNA表達(dá)的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 2～3月齡新西蘭家兔20只，體質(zhì)量2～3 kg，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。主要儀器及試劑:目樂(lè)手術(shù)顯微鏡(德國(guó)麥迪塞姆儀器有限公司，F(xiàn)S3013)、倒置相差顯微鏡與成像系統(tǒng)(日本Nikon，TE-2000-U)、熒光顯微鏡(日本 Olympus，BS51)、酶標(biāo)儀(美國(guó)伯樂(lè)，Bio-Rad680)、定量 PCR儀(美國(guó) ABI，7500Fast)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本 TAKARA，Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)兔抗鼠S-100多克隆抗體、兔抗鼠NGF多克隆抗體(美國(guó)santa cruz)。

1.2 方法

1.2.1 SCs原代培養(yǎng)及分組 選擇健康家兔10只，用5%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，無(wú)菌條件下，暴露并截取部分坐骨神經(jīng)進(jìn)行原代培養(yǎng)。差速貼壁法分離纖維母細(xì)胞，并加入G-418對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行抑制，放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后倒置相差顯微鏡下觀察其生長(zhǎng)情況。待培養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶底已鋪滿80%～90%，即可進(jìn)行傳代。

1.2.2 免疫組化染色鑒定細(xì)胞純度 取第4代細(xì)胞爬片進(jìn)行S-100免疫組化染色鑒定。按1×105/孔將細(xì)胞懸液接種到培養(yǎng)板上，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層時(shí)，進(jìn)行S-100免疫組化染色鑒定。隨機(jī)選取10個(gè)不重疊高倍視野進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率。

1.2.3 NF-κB mRNA表達(dá)檢測(cè) 取第4代優(yōu)質(zhì)細(xì)胞，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(NGF)、阻斷組(NGF和anti-NGFR)、對(duì)照組(PBS)。置于37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。按Trizol說(shuō)明書提取細(xì)胞總mRNA，溶解在DEPC水中，分別用紫外分光光度計(jì)、1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

根據(jù)PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA E-raser的說(shuō)明書合成cDNA，取2 μL產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用 Primer Express2.0設(shè)計(jì)合成引物。NF-κB:上游引物:5'-GAGCCACCAATCCACACAGAGT-3'，下游引物:5'-ATGAGCTTCTGGCGTTTCCTCT-3'，擴(kuò)增片段107 bp;β-actin:上游引物:5'-CATTGCTGACAGGATGCAGAAG-3'，下游引物:5'-GAGCCACCAATCCACACAGAGT-3'，擴(kuò)增片段108 bp。反應(yīng)條件:50℃ 2 min，90 ℃ 10 s，95 ℃ 20 s，60 ℃ 1 min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物行溶解曲線分析，單峰曲線為擴(kuò)增產(chǎn)物單一，無(wú)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。其溶解程序?yàn)?95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃15 s，60 ℃ 15 s。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR 產(chǎn)物在2.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，并照相記錄。上述過(guò)程中需要對(duì)熒光進(jìn)行收集，采用SequenceDetection Software2.2軟件在全部反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。設(shè)定闡值后，對(duì)所有樣品中NF-κB進(jìn)行PCR擴(kuò)增，達(dá)到閉值時(shí)的Ct值進(jìn)行測(cè)定;通過(guò)β-actin進(jìn)行校正，得到 NF-κB mRNA 相對(duì)表達(dá)量，即 NF-κB/β-actin。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外培養(yǎng)的SCs形態(tài)特點(diǎn) 接種24 h后，倒置顯微鏡下可見兩種貼壁生長(zhǎng)的、具有明顯形態(tài)的SCs，一種胞核為長(zhǎng)形或圓形，胞體為立體感強(qiáng)、非常飽滿的梭形體，兩端有細(xì)長(zhǎng)的突起;另一種胞核很淺，具2～3個(gè)核仁，胞體扁平、大且不規(guī)則，常常出現(xiàn)多而短的突起。

2.2 SCs純度鑒定 S-100免疫組化染色可見，SCs胞核比胞質(zhì)著色淺;邊界異常清晰，多數(shù)細(xì)胞呈梭狀，胞體兩端有數(shù)量不等的突起，形態(tài)與活體SCs相同。200倍鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)不重疊的視野，對(duì)胞質(zhì)為棕褐色的陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，SCs純度達(dá)到91%。

2.3 各組SCs內(nèi)NF-κB mRNA表達(dá)比較 紫外分光光度計(jì)觀察顯示，A260/A280為 1.8～2.2;1.5% 瓊脂糖凝膠電泳可見28、18 s兩條清晰條帶;證實(shí)提取的mRNA質(zhì)量良好。NF-κB與β-actin擴(kuò)增溶解曲線為單峰形式，表示擴(kuò)增PCR產(chǎn)物單一。對(duì)照組、阻斷組、實(shí)驗(yàn)組SCs中NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(8.01 ±0.92)×10-4、(7.86 ±0.14)×10-4、(10.94 ±1.12)×10-4。實(shí)驗(yàn)組 NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組、阻斷組(P均 ＜0.01)，而阻斷組和對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論

SCs體外培養(yǎng)和純化是研究人體周圍神經(jīng)組織修復(fù)功能、分泌蛋白的重要前提。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，動(dòng)物的年齡、材質(zhì)的提取部位對(duì)體外培養(yǎng)SCs的質(zhì)量影響較大［6，7］。在進(jìn)行 SCs體外培養(yǎng)的過(guò)程中，排除其他細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞)是獲得高純度SCs的重要保證。本實(shí)驗(yàn)先采用差速貼壁和低濃度消化酶進(jìn)行純化，再利用小濃度G-418清除殘留的成纖維細(xì)胞，因而可獲得較高純度的SCs。在對(duì)體外培養(yǎng)的SCs進(jìn)行鑒定時(shí)，采用了形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)兩種方法，結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的SCs在鏡下多數(shù)胞核呈卵圓形或長(zhǎng)形，體型為飽滿的、立體感極強(qiáng)的梭形，有2～3個(gè)細(xì)長(zhǎng)的突起，多為雙極。這與已被證實(shí)的 SCs形態(tài)相符［8，9］。另外，應(yīng)用S-100從免疫學(xué)角度對(duì)培養(yǎng)的SCs進(jìn)行鑒定，可見到經(jīng)典的SCs著色形態(tài)。證實(shí)了本研究成功建立了SCs體外培養(yǎng)的細(xì)胞模型。

NGF是SCs分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子之一，具有維護(hù)正常周圍神經(jīng)細(xì)胞存活、促進(jìn)神經(jīng)纖維快速生長(zhǎng)、修復(fù)髓鞘等作用。NGF通過(guò)兩類跨膜糖蛋白受體發(fā)揮其生物學(xué)功能，即高親和力酪氨酸激酶受體(Trka)和低親和力的p75受體［10，11］。其中p75受體屬于腫瘤壞死因子受體超家族的成員，對(duì)細(xì)胞的存活、增殖、分化、遷移、凋亡等起著重要的介導(dǎo)作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，p75受體還能在Trka受體缺乏時(shí)，與NGF結(jié)合共同激活NF-κB發(fā)揮重要的細(xì)胞信號(hào)傳遞通路作用，繼而調(diào)節(jié)一系列基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá);添加外源性NGF可以上調(diào)NF-κB mRNA的表達(dá)。這可能是由于周圍神經(jīng)受損后，SCs表面出現(xiàn)大量p75受體，而加入適量外源性NGF后，其與p75受體大量結(jié)合，促進(jìn)了NF-κB mRNA的表達(dá)，加強(qiáng)SCs增殖及其抗凋亡的作用。

總之，我們認(rèn)為外源性NGF可以上調(diào)SCs中NF-κB mRNA 的表達(dá)。

［1］沈尊理.組織工程化人工神經(jīng)研究［J］.組織工程與重建外科雜志，2006，2(4):181-183.

［2］李強(qiáng)，李民，伍亞民.神經(jīng)組織工程研究進(jìn)展［J］.中國(guó)矯形外科雜志，2003，11(4):264-266.

［3］肖峰，鄭啟新.構(gòu)建組織工程化神經(jīng)中生物支架材料的研究進(jìn)展［J］.生物骨科材料與臨床研究，2006，3(4):29-30.

［4］Gavazzi I，Cowen T.Can the neurotrophic hypothesis explain degeneration and loss of plasticity in the mature and aging autonomic nerves［J］.J Auton Nerv Syst，1996，58(1-2):1-10.

［5］Heumann R，Korsching S，Bandtlow C，et al.Changes of nerve growth factor synthesis in nonneuronal cells in response to sciatic nerve transection［J］.J Cell Biol，1987，104(6):1623-1631.

［6］Casella GT，BungeRP，Wood PM.Improved method for harvesting human Schwann cells from mature peripheral nerve and expansion in vitro［J］.Clia，1996，17(4):327-335.

［7］潘良春，尹宗生，王偉，等.新生和成年大鼠雪旺細(xì)胞培養(yǎng)、純化的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2005，20(11):817-819.

［8］張軍，許百男，周定標(biāo).乳鼠雪旺細(xì)胞的培養(yǎng)和純化［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2002，27(7):150-155.

［9］黃小強(qiáng)，羅卓荊，李明全.新生SD大鼠坐骨神經(jīng)雪旺細(xì)胞培養(yǎng)與純化的方法學(xué)研究［J］.中華創(chuàng)傷骨科雜志，2005，7(4):341-342.

［10］Metsis M.Genes for neurotrophic factors and their receptors:structure and regulation［J］.Cell Mol Life Sci，2001，58(8):1014-1020.

［11］Barker PA.p75NTR is positively promiscuous:novel partners and new insights［J］.Neuron，2004，42(4):529-533.