張亞蓮，柳 菡，王歲樓,*，李靜靜，沈偉健，趙增運(yùn)

（1.中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 南京 210001）

葡萄酒和軟木塞中2,4,6-三氯苯甲醚檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

張亞蓮1，柳 菡2，王歲樓1,*，李靜靜2，沈偉健2，趙增運(yùn)2

（1.中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 南京 210001）

本文介紹了葡萄酒和軟木塞中2,4,6-三氯苯甲醚（2,4,6-trichloroanisole，TCA）的來(lái)源及影響，分析了2,4,6-三氯苯甲醚的檢測(cè)難點(diǎn)，總結(jié)了目前檢測(cè)2,4,6-三氯苯甲醚方法的總體趨勢(shì)及現(xiàn)狀。按照前處理方法的原理分類，介紹了前處理方法的定義、特點(diǎn)，并概述和討論了前處理方法在萃取葡萄酒和軟木塞中2,4,6-三氯苯甲醚中的應(yīng)用；根據(jù)儀器檢測(cè)方法的不同特點(diǎn)，總結(jié)和討論了儀器檢測(cè)方法在分析檢測(cè)葡萄酒和軟木塞中2,4,6-三氯苯甲醚的應(yīng)用。前處理方法和儀器檢測(cè)方法相結(jié)合，達(dá)到了濃縮和檢測(cè)葡萄酒和軟木塞中2,4,6-三氯苯甲醚的目的。

2,4,6-三氯苯甲醚；葡萄酒；軟木塞；檢測(cè)方法

隨著生活水平的提高，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注葡萄酒的品質(zhì)問(wèn)題。其中2,4,6-三氯苯甲醚（2,4,6-trichloroanisole，TCA）的污染是葡萄酒行業(yè)目前所面臨的最嚴(yán)重的問(wèn)題之一，它直接影響到葡萄酒的品質(zhì)。TCA是由軟木塞中的氯酚在曲霉菌、青霉菌、木霉菌等微生物的作用下甲基化產(chǎn)生的。TCA呈木塞味，性質(zhì)穩(wěn)定，尤其是灌瓶后滲透到葡萄酒中的TCA比葡萄酒本身更穩(wěn)定[1]。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局提供的研究報(bào)告表明，由軟木塞遷移到葡萄酒中的TCA質(zhì)量濃度為2.4～210.0 ng/L[1-2]，而消費(fèi)者不可接受的TCA異味的閾值水平一般在3.1 ng/L左右[3]。據(jù)估計(jì)，2%～5%的葡萄酒會(huì)受到TCA污染[2,4]，全球每年因此而造成的葡萄酒損失達(dá)到100億美元。

葡萄酒中的TCA在極低含量（ng/L水平）時(shí)就可產(chǎn)生木塞味，這要求檢測(cè)TCA含量的方法靈敏度極高。目前，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)葡萄酒和軟木塞中TCA的方法較多。前處理方法有固相微萃取、液液微萃取和免疫親和固相萃取，其中以頂空固相微萃取的使用為主。儀器檢測(cè)方法有氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)器、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法以及其他檢測(cè)方法（如離子流動(dòng)性光譜法、酶聯(lián)免疫分析），其中以氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)器和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的使用為主。本文對(duì)近幾年來(lái)葡萄酒和軟木塞中TCA的前處理方法和儀器分析檢測(cè)方法進(jìn)行了概述和討論，旨在為相關(guān)研究提供文獻(xiàn)基礎(chǔ)。

1 前處理方法

TCA在葡萄酒中的含量極低，需要采用富集倍數(shù)高的前處理方法提取。在測(cè)定軟木塞中的TCA時(shí)，檢測(cè)的是軟木塞可轉(zhuǎn)移到葡萄酒中的TCA含量。一般先將軟木塞在一定濃度的乙醇溶液（模擬葡萄酒基質(zhì)）中浸泡或超聲一段時(shí)間，再對(duì)浸泡液進(jìn)行提取濃縮。目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)葡萄酒和軟木塞浸泡液中TCA的前處理方法有固相微萃取、液液微萃取和免疫親和固相萃取法。

1.1 固相微萃取

固相微萃取是目前國(guó)內(nèi)外較為常用的一種樣品前處理和富集技術(shù)，其操作簡(jiǎn)單、無(wú)需有機(jī)溶劑、分析速度快、可自動(dòng)化，是大部分實(shí)驗(yàn)室在對(duì)葡萄酒和軟木塞中痕 量TCA提取時(shí)首選的前處理方法。目前，常用的固相微萃取技術(shù)有頂空固相微萃取、攪拌棒吸附萃取和浸入式固相微萃取。影響TCA固相微萃取效果的因素有：纖維涂層的種類和厚度、萃取溫度、萃取時(shí)間、振動(dòng)速率（攪拌速率）、離子濃度和溶液pH值等，需要對(duì)這些因素進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到最優(yōu)的萃取效果。

1.1.1 頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）

HS-SPME是將涂有高分子固相液膜的石英纖維停放在樣品溶液上方，吸附揮發(fā)出的待測(cè)物，然后將纖維頭插入進(jìn)樣口解吸，供氣相色譜分析。該方法不與樣品基質(zhì)接觸，避免了基體干擾，是目前揮發(fā)性化合物較為常用的一種前處理方法[1]。鄧曉軍等[1]比較了采用不同纖維涂層時(shí)TCA的回收率，最終選取75 μm碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（CAR/PDMS）涂層纖維頭對(duì)葡萄酒中TCA進(jìn)行HS-SPME，采用2,4,6-三氯甲苯作為內(nèi)標(biāo)，用氣相色譜串聯(lián)離子阱質(zhì)譜法（gas chromatography-tandem ion trip mass spectrometry，GC-ITMS）檢測(cè)，測(cè)得TCA的定量限（limit of quantitation，LOQ）為2.0 ng/L。張素娟等[4]采用50/30 μm聚二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）涂層纖維頭對(duì)葡萄酒中的TCA進(jìn)行超聲波輔助頂空固相微萃取，用氣相色譜電子捕獲檢測(cè)器（gas chromatography-electron capture detection，GC-ECD）檢測(cè)，其LOQ為0.5 ng/L。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織建立了軟木塞中TCA的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)（ISO 20752—2007）[5]：采用12%乙醇模擬葡萄酒基質(zhì)，將軟木塞在12%乙醇中浸泡（24±2）h，用100 μm聚二甲基硅氧烷（PDMS）涂層纖維頭對(duì)浸泡液進(jìn)行HS-SPME，應(yīng)用GC-ECD或氣相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器（gas chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry，GC-MS）測(cè)定TCA，其LOQ可達(dá)到0.5 ng/L。Riu[6]、Alzaga[7]、Zapata[8]、陳樹(shù)兵[9]等也在研究中使用HS-SPME對(duì)葡萄酒中TCA進(jìn)行萃取。由于HS-SPME具有富集倍數(shù)高、操作簡(jiǎn)單易行、完全自動(dòng)化的特點(diǎn)，大多數(shù)學(xué)者均選擇HS-SPME檢測(cè)葡萄酒和軟木塞中的TCA。它是目前檢測(cè)TCA最為常用的一種前處理技術(shù)。

在采用HS-SPME分析葡萄酒和軟木塞中的TCA時(shí)，常用的纖維涂層有：75 μm CAR/PDMS、50/30 μm DVB/ CAR/PDMS、100 μm PDMS和65 μm PDMS/DVB。75 μm CAR/PDMS適合分析氣體和低相對(duì)分子質(zhì)量化合物，50/30 μm DVB/CAR/PDMS適合分析芳香化合物（揮發(fā)性和半揮發(fā)性C3～C20），100 μm PDMS適合分析非極性揮發(fā)性物質(zhì)， 65 μm PDMS/DV B適合分析揮發(fā)性物質(zhì)、胺類、硝基芳香類化合物。這些纖維萃取頭均含有PDMS，其為非極性涂層，對(duì)非極性物質(zhì)如揮發(fā)性化合物、多環(huán)芳烴、芳香烴等的提取具有較好的效果。將CAR、DVB這些聚合物加到涂層中，可增大涂層的表面積，提高HS-SPME的萃取效率。

1.1.2 攪拌棒吸附萃取（stir bar sorptive extraction，SBSE）

SBSE是一種新型固相微萃取樣品前處理技術(shù)，它是將PDMS套在內(nèi)封磁芯的玻璃管上作為萃取涂層，對(duì)樣品中的待測(cè)物進(jìn)行吸附，待萃取完成后，通過(guò)熱解吸儀對(duì)待測(cè)物進(jìn)行熱解吸，供氣相色譜分析[10]。HS-SPME和IS-SPME用到的纖維頭最多只可涂布0.6 μL PDMS，而SBSE用到的纖維頭最多可涂布24 μL PDMS，這使SBSE的理論吸附量是它們的40倍[11]。SBSE固定相體積大大增加，提高了方法的靈敏度，適 用于樣品中超痕量組分的分析[11-12]。而且SBSE無(wú)需外加攪拌子，可避免競(jìng)爭(zhēng)性吸附，能在自身攪拌的同時(shí)實(shí)現(xiàn)萃取富集[10,12]。

Maggi等[11]比較了SBSE、HS-SPME和IS-SPME對(duì)葡萄酒中TCA的提取，3種方法萃取后均用GC-ITMS檢測(cè)，結(jié)果顯示用SBSE提取TCA靈敏度最高，檢測(cè)限（limit of detection，LOD）和LOQ分別為0.03、0.10 ng/L。Vestner等[13]將軟木塞置于10%乙醇（模擬葡萄酒基質(zhì)）中，室溫下浸泡24 h或者超聲輔助萃取軟木塞中TCA，然后采用0.5 mm PDMS攪拌棒對(duì)軟木塞浸泡液進(jìn)行萃取，用GC-MS測(cè)得其LOQ可達(dá)到0.7 ng/L。

1.1.3 浸入式固相微萃?。╥mmersion solid-phase microextraction，IS-SPME）

IS-SPME是將涂有高分子固相液膜的石英纖維直接插入到樣品溶液或氣樣中，吸附其揮發(fā)或半揮發(fā)性成分，待吸附完成后，將纖維萃取頭插入進(jìn)樣口進(jìn)行解吸，供氣相色譜分析[11,14]。Maggi等[11]采用100 μm PDMS纖維萃取頭在室溫、700 r/min下對(duì)葡萄酒樣品進(jìn)行IS-SPME，同時(shí)用相同的纖維萃取頭在35 ℃、700 r/ min條件下對(duì)葡萄酒樣品進(jìn)行HS-SPM E，然后均用GC-ITMS檢測(cè)，結(jié)果顯示ISSPME的靈敏度較高，測(cè)得TCA的LOD為0.46 ng/L。

1.2 液液微萃取

液液微萃取是使用少量的有機(jī)溶劑（＜200 μL）對(duì)相對(duì)大量液體進(jìn)行萃取。它是基于物質(zhì)在有機(jī)相與水相間的平衡，通過(guò)大大減少有機(jī)相與水相的體積比，以提高富集倍數(shù)，有利于減少基體干擾，是近幾年發(fā)展較快的一種新型前處理技術(shù)。它可將目標(biāo)物的萃取、純化、濃縮集中在一步操作中完成，而且成本低，不使用萃取纖維避免了纖維易損的缺點(diǎn)[15-17]，為葡萄酒和軟木塞中TCA的提取提供了一種新的前處理方法。一些不具備固相微萃取條件的實(shí)驗(yàn)室，可通過(guò)液液微萃取法來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)痕量物質(zhì)的提取濃縮。目前用于TCA提取的液液微萃取技術(shù)有基于有機(jī)溶劑的頂空單液滴微萃取、基于離子液體的頂空單液滴微萃取、分散液液微萃取和超聲輔助乳化液液微萃取。影響液液微萃取效率的因素主要有：萃取溶劑（和/或分散劑）、萃取溫度、萃取時(shí)間、樣品pH值和離子強(qiáng)度等，需要對(duì)這些因素進(jìn)行考察，以得到最優(yōu)的萃取效率。

1.2.1 基于有機(jī)溶劑的頂空單液滴微萃?。╫rganic solvent-based headspace single drop microextraction，OSHS-SDME）

OS-HS-SDME是指取微量進(jìn)樣器，吸取一定體積（一般為幾微升）的有機(jī)萃取溶劑，將其插入樣品瓶，然后將萃取溶劑擠出使其懸掛于微量進(jìn)樣器針尖的頂端，并使針尖暴露在樣品溶液上空（一般距離1 cm），待萃取完成后抽回萃取液滴并將微量進(jìn)樣器從樣品瓶中拔出，直接將此液滴注射到氣相色譜中分析的過(guò)程，是一種使用有機(jī)溶劑最少的液液微萃取技術(shù)[15-19]。

Martendal等[15]采用微量進(jìn)樣器吸取2 μL 1-正辛醇萃取溶劑，頂空單液滴微萃取20 mL干紅葡萄酒和合成葡萄酒（成分：11%乙醇（體積分?jǐn)?shù)）、0.25 g/mL酒石 酸、0.30 g/mL乳酸和0.60 g/mL丙三醇）樣品中TCA，并用GC-ECD檢測(cè)，其LOD為8.1 ng/L。該方法成本低，分析速度快，同時(shí)避免了HS-SPME中纖維涂層易損的缺點(diǎn)。但有機(jī)萃取溶劑體積小，易揮發(fā)、穩(wěn)定性低，導(dǎo)致該方法的重現(xiàn)性低。

1.2.2 基于離子液體的頂空單液滴微萃?。╥onic liquidbased headspace single drop microextraction，IL-HS-SDME）

IL-HS-SDME與OS-HS-SDME唯一不同的是，使用的萃取溶劑是離子液體。離子液體是指在室溫及接近室溫下完全由陰陽(yáng)離子組成的呈現(xiàn)液態(tài)的物質(zhì)，是一類新型的軟介質(zhì)和功能材料，其一般是由體積相對(duì)較大的有機(jī)陽(yáng)離子和體積較小的無(wú)機(jī)陰離子構(gòu)成，常見(jiàn)的有咪唑離子、吡啶離子、烷基銨鹽等陽(yáng)離子和鹵素離子、含F(xiàn)、P、S的離子等陰離子[20]。與傳統(tǒng)有機(jī)溶劑相比，離子液體是一種新型綠色溶劑，具有低揮發(fā)性、熱穩(wěn) 定強(qiáng)、黏度大、雙重極性、高疏水性等優(yōu)點(diǎn)[20-23]。

Marquez-sillero等[21]對(duì)2 mL葡萄酒樣品進(jìn)行固相萃取凈化后，將所得溶液用高純水稀釋至8 mL，然后采用微量進(jìn)樣器在其尖端吸附2 μL離子液體并置于稀釋液上空1 cm處，吸附葡萄酒樣品中的TCA，最后用離子流動(dòng)性光譜法（ion mobility spectrometry，IMS）檢測(cè)。他們考察了1-己基-3-甲基咪唑雙（三氟甲基黃酰基）亞胺鹽（[Hmim][NTf2]）、1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（Omim-PF6）和1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（Hmim-PF6）3種離子液體，結(jié)果顯示三者的提取效率均很高，但[Hmim][NTf2]在使用IMS檢測(cè)時(shí)不產(chǎn)生干擾信號(hào)，故選取[Hmim][NTf2]離子液體對(duì)葡萄酒中TCA進(jìn)行提取，在上述條件下TCA的LOD為0.2 ng/L。該方法降低了分析成本，減少了對(duì)環(huán)境的污染，精密度高。

1.2.3 分散液液微萃取（dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME）

DLLME是根據(jù)待測(cè)物在水相（樣品溶液）和有機(jī)相（萃取劑和分散劑）之間的不同分配系數(shù)，通過(guò)待測(cè)物在兩相間的分配進(jìn)行萃取富集，其中分散劑的作用是使樣品與萃取溶劑間形成較大的接觸面，有利于分析物在萃取溶劑中的快速提取，幾秒內(nèi)即可達(dá)到萃取平衡[19,24-25]。其操作過(guò)程一般是，將含有微升級(jí)萃取溶劑的分散劑（毫升級(jí)，一般為1～2 mL）通過(guò)微量注射器快速注入到含樣品液（毫升級(jí)）的離心管中，輕輕振蕩使其形成渾濁液，待達(dá)到平衡后高速離心，用微量進(jìn)樣器吸取一定量的萃取溶劑供分析儀器測(cè)定[24]。該方法保持了SDME使用萃取劑體積小的優(yōu)點(diǎn)，保持了較高的富集倍數(shù)；同時(shí)它也避免了萃取劑微滴體積小帶來(lái)的不穩(wěn)定性，加快了萃取速度，是一種有發(fā)展?jié)摿Φ姆蛛x富集技術(shù)[19]。

Pizarro等[25]采用微量進(jìn)樣器吸取173 μL三氯甲烷萃取溶劑和1.43 mL丙酮分散劑快速注入到5 mL葡萄酒樣品中，振蕩形成由分散在葡萄酒樣品內(nèi)的三氯甲烷微珠組成的渾濁液，室溫下不加鹽萃取葡萄酒中TCA，待萃取完成后離心，用 微量進(jìn)樣器吸取有機(jī)相注入到進(jìn)樣小瓶中供GC-ITMS分析，其LOD為0.5 ng/L。

1.2.4 超聲輔助乳化液液微萃?。╱ltrasound-assisted emusification liquid-liquid microextraction，USAEME）

USAEME是利用超聲波使樣品溶液中微升級(jí)的有機(jī)萃取溶劑發(fā)生均勻乳化，并迅速達(dá)到傳質(zhì)平衡，高效萃取樣品中的待測(cè)物，離心分離水相和有機(jī)相，用微量進(jìn)樣器吸取有機(jī)相直接用于氣相或氣質(zhì)分析的一種分離富集技術(shù)[26-27]。

Fontana等[27]取5 mL葡萄酒樣品，向其加入25 μL三氯乙烯萃取溶劑，在20 ℃超聲5 min，待其乳化后高速離心以破環(huán)乳化液分離兩相，離心后使三氯乙烯萃取溶劑保留在錐形管底部10 μL，用5 μL微量進(jìn)樣器吸取1 μL三氯乙烯進(jìn)樣，用GC-ITMS分析，其LOD為0.7 ng/L。該方法降低了LOD，使其靈敏度提高。

1.3 免疫親和固相萃取

除了以上萃取方法外，有學(xué)者還采用免 疫親和固相萃取對(duì)葡萄酒中TCA進(jìn)行提取。免疫親和固相萃取是基于抗原抗體反應(yīng)，免疫親和柱中含有和待測(cè)物相結(jié)合的凝膠，樣品中待測(cè)物經(jīng)提取、過(guò)濾、稀釋，然后緩慢通過(guò)免疫親和層析柱，再經(jīng)過(guò)洗滌將未被結(jié)合的物質(zhì)除去，最后將待測(cè)物洗脫下來(lái)進(jìn)行分析。Sanvicens等[28]將葡萄酒樣品用磷酸鹽緩沖液稀釋，再采用IS90免疫親和柱對(duì)稀釋液進(jìn)行免疫親和固相萃取，然后用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)TCA，其LOD為440 ng/L。該方法特異性強(qiáng)、成本低，但靈敏度不高。

2 儀器檢測(cè)方法

TCA為弱極性半揮發(fā)性有機(jī)化合物，且在葡萄酒中的含量極低，檢測(cè)葡萄酒和軟木塞中TCA含量的方法多使用氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)器、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，有學(xué)者也使用離子流動(dòng)性光譜法、酶聯(lián)免疫吸附分析等方法。

2.1 氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)器（gas chromatographyelectron capture detection，GC-ECD）

TCA分子中含有3個(gè)氯原子，電負(fù)性較強(qiáng)，許多學(xué)者使用ECD檢測(cè)葡萄酒和軟木塞中的TCA，其選擇性好、靈敏度高。ISO 20752—2007[5]采用GC-ECD檢測(cè)軟木塞浸泡液中的TCA，其LOQ為0.5 ng/ L。Riu等[6]采用HS-SPME對(duì)干白、干紅葡萄酒中的TCA進(jìn)行提取濃縮，GC-ECD檢測(cè)其含量，結(jié)果測(cè)得在兩種基質(zhì)中的LOQ分別為5、8 ng/L。Alzaga等[7]也曾采用HS-SPME-GC-ECD技術(shù)對(duì)葡萄酒中TCA進(jìn)行提取和檢測(cè)，測(cè)得TCA的LOQ為2.9 ng/L。張素娟[4]、Martendal[15]、衛(wèi)曉紅[29]等均在研究TC A的過(guò)程中使用GC-ECD對(duì)其進(jìn)行分析。

2.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

目前，用于檢測(cè)葡萄酒和軟木塞中TCA的氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法中，氣相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法、氣相色譜串聯(lián)離子阱質(zhì)譜法使用較多，氣相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法使用較少。

2.2.1 氣相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法

與GC-ECD相比，GC-MS定性更可靠，選擇性和靈敏度更高。ISO 20752—2007[5]在采用HS-SPME對(duì)軟木塞浸泡液中的TCA進(jìn)行提取后，GC-ECD檢測(cè)，同時(shí)又用GC-MS對(duì)TCA進(jìn)行確認(rèn)：以其質(zhì)荷比（m/z）210、212為T(mén)CA的定性離子，以m/z 195為T(mén)CA的定量離子，其LOQ為0.5 ng/L。Vestner等[13]采用超聲波輔助攪拌棒吸附萃取對(duì)軟木塞中TCA進(jìn)行提取，然后采用EI離子源，GC-MS選擇離子檢測(cè)模式檢測(cè)TCA，以其m/z 210、212為定量離子，內(nèi)標(biāo)法定量，測(cè)得的LOQ為0.7 ng/L。劉卿等[30]采用固相微萃取氣相色譜負(fù)化學(xué)源電離的質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)葡萄酒中的TCA，選擇離子監(jiān)測(cè)模式下，以m/z 174.2、176.2、210.1、212.1為T(mén)CA的定性離子，其中m/z 174.2又作為T(mén)CA的定量離子，內(nèi)標(biāo)法定量，測(cè)得LOQ為0.2 ng/L。

2.2.2 氣相色譜串聯(lián)離子阱質(zhì)譜法（gas chromatographytandem ion trip mass spectrometry，GC-ITMS）

離子阱質(zhì)譜檢測(cè)器可實(shí)現(xiàn)時(shí)間上的串聯(lián)，進(jìn)行多級(jí)質(zhì)譜掃描，靈敏度高，掃描質(zhì)量范圍大，應(yīng)用范圍廣。鄧曉軍等[1]采用HS-SPME對(duì)葡萄酒中TCA進(jìn)行提取，GC-ITMS檢測(cè)：選取m/z 210作為母離子，對(duì)其進(jìn)行子離子全掃描，發(fā)現(xiàn)主要的子離子m/z 195的峰強(qiáng)度比較高，以其作為T(mén)CA的定性、定量離子，檢測(cè)到的LOQ為2.0 ng/L。Pizarro等[25]采用DLLME處理樣品，然后用EI離子源，GC-ITMS檢測(cè)葡萄酒中TCA，其定性離子和定量離子分別為一級(jí)質(zhì)譜特征離子峰m/z 195和二級(jí)質(zhì)譜特征離子峰m/z 167，測(cè)得LOD為5 ng/L。Fontana等[27]采用USAEME前處理方法，GC-ITMS多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）檢測(cè)葡萄酒中的TCA，以其一級(jí)質(zhì)譜特征離子峰m/z 197為T(mén)CA的定量離子，以其二級(jí)質(zhì)譜特征離子峰m/z 167為T(mén)CA的定性離子，其LOD為0.7 ng/L。

2.2.3 氣相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法（gas chromatographytandem triple quadrupole mass spectrometry，GC-MS-MS）

GC-MS-MS可進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，其抗干擾能力強(qiáng)，定性能力強(qiáng)，分析時(shí)間短。陳樹(shù)兵等[9]采用100 μm PDMS纖維萃取頭對(duì)葡萄酒中TCA進(jìn)行HS-SPME，用HP-5毛細(xì)管柱（3 0 m×0.25 mm，0.25 μm），GC-MSMS多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)TCA，其定性離子和定量離子分別為m/z 166.9、m/z 195.0，外標(biāo)法定量，測(cè)得LOD為0.01 ng/L，靈敏度高。

2.3 其他檢測(cè)方法

除上述檢測(cè)方法外，一些學(xué)者還使用 離子流動(dòng)性光譜法、酶聯(lián)免疫吸附分析、多孔生物檢測(cè)器和電子鼻等方法。

2.3.1 離子流動(dòng) 性光譜法（i on mobility spectrometry，IMS）

IMS是利用氣相離子在弱電場(chǎng)中的遷移率來(lái)測(cè)定物質(zhì)的方法。它的原理與飛行時(shí)間質(zhì)譜相似，主要區(qū)別是IMS不需要真空[31]。它體積小、質(zhì)量輕、耗能少、價(jià)格便宜、靈敏度高、適用范圍廣，能用于在線分析，但選擇性差、線性范圍窄。Marquez-Sillero等[21]采用基于離子液體的頂空單液滴微萃取處理葡萄酒樣品，以氚作為離子源，在負(fù)離子模式下，使用IMS檢測(cè)葡萄酒中TCA，其LOD和LOQ分別可達(dá)到0.2、0.66 ng/L。該方法成本低，分析速度快，所用儀器設(shè)備簡(jiǎn)單。

2.3.2 酶聯(lián)免疫吸附分析法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA是將抗原抗體反應(yīng)的高度特異性和酶的高效催化作用相結(jié)合而建立的一種免疫分析方法，其主要是基于抗原或抗體能吸附至固相載體的表面并保持其免疫活性，抗原或抗體與酶形成的酶結(jié)合物仍保持其免疫活性和酶催化活性[32]。Sanvicens等[33]采用As78抗血清與C9-OVA卵清蛋白作為包被抗原，使用羊抗兔IgG抗體，然后用ELISA檢測(cè)干白、干紅葡萄酒中的TCA，其LOD分別為200 ng/L和1 μg/L；在半數(shù)抑制濃度IC50大于5 000 nmol/L時(shí)，除2,4,6-三溴苯甲醚外，TCA與其他結(jié)構(gòu)類似物不存在交叉反應(yīng)。ELISA特異性強(qiáng)，但靈敏度不高，對(duì)于葡萄酒中更低濃度TCA 的檢測(cè)會(huì)受到其他結(jié)構(gòu)類似物的競(jìng)爭(zhēng)限制。

2.3.3 多孔生物檢測(cè)器法

細(xì)胞生物傳感器是以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為基礎(chǔ)并用生物電識(shí)別檢測(cè)。生物電識(shí)別檢測(cè)是基于細(xì)胞膜內(nèi)含有人工制造的待測(cè)物特異性抗體，可與樣品中的待測(cè)物結(jié)合，使固定細(xì)胞的膜電位改變并對(duì)其識(shí)別，從而對(duì)待測(cè)物進(jìn)行檢測(cè)[34]。Varelas等[34]按照ISO 20752—2007標(biāo)準(zhǔn)[5]將軟木塞置于體積分?jǐn)?shù)為12%的乙醇中浸泡，然后采用以生物電識(shí)別檢測(cè)為基礎(chǔ)的細(xì)胞生物傳感器檢測(cè)軟木塞浸泡液和葡萄酒中TCA，其能夠在幾分鐘內(nèi)檢測(cè)到0.1 ng/L水平的TCA。該方法具有超高的靈敏度、超快的檢測(cè)速度以及低成本檢測(cè)的特點(diǎn)，是一種快速檢測(cè)TCA的新型技術(shù)。

2.3.4 電子鼻法

電子鼻是以模擬天然氣味識(shí)別系統(tǒng)為特征，通過(guò)具有交叉選擇性的傳感器陣列與合適的數(shù)據(jù)處理技術(shù)相配合，來(lái)檢測(cè)樣品中待測(cè)物的一種技術(shù)[35]。Santos等[36]使用基于薄膜半導(dǎo)體感受器的電子鼻檢測(cè)葡萄酒中TCA的閾值，并與人類感官陪審團(tuán)的檢測(cè)值比較，結(jié)果顯示電子鼻 有一定的優(yōu)勢(shì)。該方法可用于TCA的閾值檢測(cè)，不適于TCA的準(zhǔn)確定性與定量，應(yīng)用范圍較小。

3 結(jié) 語(yǔ)

綜上所述，在對(duì)葡萄酒和軟木塞浸泡液進(jìn)行TCA萃取的方法中，早期固相微萃取技術(shù)的應(yīng)用較為廣泛，其中又以HS-SPME的使用為主。固相微萃取操作簡(jiǎn)單、分析速度快、無(wú)需有機(jī)溶劑，集采樣、萃取、濃集、進(jìn)樣于一體，但是固相微萃取使用萃取纖維，萃取纖維有易損的缺點(diǎn)，且固相微萃取對(duì)儀器的依賴度較高。而近幾年液液微萃取技術(shù)因其成本低、富集倍數(shù)高，在TCA的檢測(cè)中發(fā)展較快，成為固相微萃取技術(shù)的有力補(bǔ)充。儀器檢測(cè)方法中多使用氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)器和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法，由于TCA含有3個(gè)氯原子，因而電負(fù)性較強(qiáng)，使用電子捕獲檢測(cè)器的靈敏度完全可以滿足檢測(cè)要求。而氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法的抗干擾能力和定性能力更強(qiáng)。HS-SPME和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法相結(jié)合，從前處理到分析檢測(cè)完全自動(dòng)化，操作簡(jiǎn)單，分析速度快，適用于大批量分析，是目前TCA檢測(cè)中應(yīng)用最為廣泛的方法。

目前，液液微萃取技術(shù)在葡萄酒和軟木塞的TCA萃取中應(yīng)用較少。但液液微萃取技術(shù)具有成本低、使用設(shè)備簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)，這將推動(dòng)其在TCA萃取中的廣泛使用。同時(shí)，隨著氣相色譜分離技術(shù)和質(zhì)譜檢測(cè)能力的不斷提高，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法在TCA檢測(cè)分析中的應(yīng)用會(huì)越來(lái)越廣泛，這將對(duì)葡萄酒和軟木塞中 TCA的檢測(cè)研究起到巨大的促進(jìn)作用。

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Progress in the Detection of 2,4,6-Trichloroanisole in Wine and Cork Stoppers

ZHANG Ya-lian1, LIU Han2, WANG Sui-lou1,*, LI Jing-jing2, SHEN Wei-jian2, ZHAO Zeng-yun2
(1. College of Pharmacy, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China; 2. Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Nanjing 210001, China)

This article descr ibes the source and impact on the flavor quality of wine of 2,4,6-trichloroanisole (TCA) in wine and cork stoppers, analyzes obstacles to the detection of TCA, and summarizes the currently available analytical methods for TCA in wine and cork stoppers. Sample pretreatment methods are classified by their principles, and their definitions, characteristics and applications for TCA detection in wine and cork stoppers are discussed. Also summarized are the characteristics and applications to detect TCA in wine and cork stoppers of different analytical instruments. To conclude, the combination of extraction techniques and instrumental detection enables the condensation and analysis of TCA in wine and cork stoppers.

2,4,6-trichloroanisole (TCA); wine; cork stoppers; detection methods

TS262.6；TS207.3

A

1002-6630（2014）15-0304-06

10.7506/spkx1002-6630-201415060

2014-03-15

國(guó)家質(zhì)檢總局科技項(xiàng)目（2011KJ39；2012KJ31）；江蘇省科技廳科技計(jì)劃項(xiàng)目（BE2009560）

張亞蓮（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail：drecotyl1988@163.com

*通信作者：王歲樓（1961—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail：cpuwsl@126.com