張春瑩，黃玉霞，袁 余，胡孝素，馬 瑩

利什曼病是一種由利什曼原蟲引起的、經(jīng)白蛉叮咬傳播的寄生蟲病。由于流行地域及生態(tài)環(huán)境復(fù)雜，人和其他宿主中存在多種利什曼原蟲，其傳播媒介和動(dòng)物宿主呈多樣性和交叉性。在我國，人的利什曼病按地理來源、傳播媒介等流行特點(diǎn)可分為平原型、山丘型和荒漠型3種類型[1]。不同類型的利什曼病其傳染源、病人臨床表現(xiàn)等方面存在差異，預(yù)防控制措施也不同。由于不同種的利什曼原蟲導(dǎo)致不同類型的利什曼病，因此快速、準(zhǔn)確地對(duì)利什曼病病原體進(jìn)行種株鑒定和系統(tǒng)發(fā)生研究對(duì)于利什曼病的診治和預(yù)防非常重要。由于利什曼原蟲的分型和種系發(fā)育復(fù)雜，而形態(tài)學(xué)方法難以區(qū)分出不同的種，因此更多的研究者傾向使用分子生物學(xué)方法對(duì)利什曼原蟲進(jìn)行鑒定、分型，但是不同研究者使用不同的分子生物學(xué)方法得到的結(jié)論不一致[2-4]，因此中國利什曼原蟲的種株鑒定仍處于不明確、有爭議的狀態(tài)。熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)是一種保守蛋白，該蛋白和其編碼基因可用于不同利什曼原蟲的種株鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究[5-6]。本研究通過對(duì)分離自我國各疫區(qū)不同宿主利什曼原蟲的hsp70基因進(jìn)行序列測定和分析，探討利什曼原蟲中國分離株種系發(fā)育關(guān)系，并將我國利什曼原蟲和國外其他流行區(qū)的利什曼原蟲hsp70基因序列共同分析，了解中國利什曼原蟲與世界其他地區(qū)流行的利什曼原蟲在種系發(fā)育和分子進(jìn)化上的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1利什曼原蟲蟲株來源 中國利什曼原蟲分離株及WHO利什曼原蟲參照株由本室保存，蟲株詳細(xì)信息及hsp70基因的GenBank登錄號(hào)見表1。

表1 利什曼原蟲蟲株詳細(xì)信息及hsp70基因序列GenBank登錄號(hào)

(B) 從GenBank下載了hsp70基因序列的利什曼原蟲蟲株。The Leishmania strains whose sequences were taken from GenBank.MHOM/BR/07/WCL. chagasiFN395036MCAN/BR/06/MAIKEL. chagasiFN395035MHOM/MA/67/IMT-AP263L. infantumFN395033MHOM/PT/00/IMT260L. infantumFN395032MHOM/MT/85/BuckL. infantumFN395031MHOM/IN/00/DEVIL. donovaniFN395028MHOM/SD/82/GilaniL. donovaniFN395029MHOM/SD/97/LEM3463L. archibaldiFN395030MHOM/KE/81/NLB_030BL. tropicaFN395026MHOM/IN/79/DD7L. tropicaFN395025NLB_107-08L. aethiopicaFN395019MHOM/ET/89/GEREL. aethiopicaFN395018UQ_8L. majorFN395022GithureL. majorFN395024MHOM/BR/73/M2269L. amazonensisEU599090MNYC/BZ/62/M379L. mexicanaEU599091MHOM/VE/76/JAP78L. garnhamiEU599092MHOM/PE/02/LH2312L. mexicanaFN395038MHOM/PE/91/LC1581L. lainsoniFN395048MHOM/PE/03/LC2525L. lainsoniFN395050MHOM/BO/95/CUM71L. lainsoniFN395047MHOM/PE/01/PER002/0L. braziliensisFR715986MHOM/BO/94/CUM29L. braziliensisFN395041MHOM/PE/91/LC2177CL2L. braziliensisEU599088IWHI/BR/1985/IM2326L. shawiGU071175MCEB/BR/1984/M8408L. shawiGU071177MHOM/BR/2002/RBO01L. guyanensisGU071178MHOM/PE/02/LH2372L. guyanensisFN395051MHOM/GF/85/LEM699L. guyanensisFN395052MCHO/PA/00/M4039L. panamensisFN395055MHOM/PA/71/LS94L. panamensisEU599094

1.2方法

1.2.1利什曼原蟲基因組DNA(nDNA)的提取 復(fù)蘇液氮保存的利什曼原蟲蟲株轉(zhuǎn)入NNN培養(yǎng)基，擴(kuò)大培養(yǎng)后用飽和酚-氯仿法提取基因組DNA[7]，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2hsp70基因PCR擴(kuò)增和序列測定 PCR引物為：正向 3′-GACGGTGCCTGCCTACTTCAA-5′，反向3′- CCGCCCATGCTCTGGTACATC-5′。引物由英濰捷基(invitrogen，上海)貿(mào)易有限公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性60 s，Y℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。取3 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠(含5 μL/100 mL溴化乙錠)電泳后，用紫外凝膠成像儀觀察擴(kuò)增條帶。將預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測定，測序工作由華大基因完成。

1.2.3種系發(fā)育分析：采用ContigExpress軟件(http://www.contigexpress.com/)進(jìn)行雙向序列拼接，根據(jù)峰形圖對(duì)序列信息進(jìn)行手工校正。使用分子進(jìn)化遺傳分析工具(molecular evolution genetics analysis, MEGA)[8]進(jìn)行多序列比對(duì), 將整理后的序列提交GenBank以獲得序列登錄號(hào)。采用jModelTest v.0.1.1軟件[9]分析核苷酸序列，選擇合適的進(jìn)化模型，用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。用MEGA 5.0軟件構(gòu)建Neighbor-Joining (NJ)樹，推測中國利什曼原蟲分離株間的系統(tǒng)發(fā)育情況，采用自展分析法(bootstrapping analysis)對(duì)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行評(píng)估。從在線基因數(shù)據(jù)庫(NCBI、EMBL或DDBJ)中下載其他利什曼原蟲分離株相應(yīng)編碼基因的核苷酸序列資料，將本研究獲得的序列和下載的序列一起比對(duì)，重建系統(tǒng)發(fā)生樹，推測中國分離株在世界利什曼原蟲分離株的系統(tǒng)發(fā)生和分子進(jìn)化中的地位。

2 結(jié) 果

2.1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳，各利什曼原蟲分離株均擴(kuò)增出與預(yù)期長度一致的hsp70基因的清晰條帶，無非特異性條帶出現(xiàn)，空白對(duì)照為陰性。

2.2hsp70基因序列測定及同源性比較 用雙脫氧核糖核酸末端終止法進(jìn)行雙向測序，根據(jù)峰形圖對(duì)序列信息進(jìn)行校正，當(dāng)峰形與堿基不一致時(shí)，通過人工比對(duì)進(jìn)行手工校正。采用ContigExpress軟件進(jìn)行雙向序列拼接，獲得約1 300 bp長度的hsp70基因序列。將整理后的hsp70基因序列提交GenBank，獲得序列登錄號(hào)見表1。使用MEGA 5.0軟件對(duì)hsp70基因序列進(jìn)行多序列比對(duì)，WHO參照株巴西利什曼原蟲(L.braziliensis)M2903表現(xiàn)出最大的多態(tài)性。在所分析的1 278 bp長度的hsp70基因序列中，有95個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，當(dāng)排除M2903后比較，出現(xiàn)56個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。Z-test檢測壓力選擇，hsp70基因在進(jìn)化中保持中性，不受選擇壓力的影響。

2.3種系發(fā)育分析 MEGA 5.0 軟件構(gòu)建鄰接樹(Neighbor-Joining tree)，樹形結(jié)構(gòu)顯示中國各疫區(qū)不同宿主的利什曼原蟲分離株聚集為不同種類的4群(圖1)。13株人來源或犬來源的利什曼原蟲與WHO參照株DD8聚為A群，為杜氏利什曼原蟲(L.donovani)。來自新疆沙鼠或白蛉的分離株與WHO參照株3720聚為B群，為都蘭利什曼原蟲(L.turanica)；分離自新疆白蛉的利什曼原蟲(SELF-7)和分離株內(nèi)蒙古沙鼠的利什曼原蟲(EJNI-154)聚為C群，為沙鼠利什曼原蟲(L.gerbilli)，在系統(tǒng)發(fā)育樹中C群與B群相距較近；D群中包含兩株，分別為一株內(nèi)蒙古蜥蜴的分離株LIZRD和一株新疆白蛉的分離株KXG-E，為蜥蜴利什曼原蟲(Sauroleishmania)。D群與A、B、C群的蟲株差異較大，因而在系統(tǒng)發(fā)育樹中單獨(dú)聚為較遠(yuǎn)的一支。WHO參照株K-27(熱帶利什曼原蟲，L.tropica)、5AS(碩大利什曼原蟲，L.major)和L100(埃塞俄比亞利什曼原蟲，L.eathiopica)由于與中國分離株存在較大差異而歸入其他分支，M2903(巴西利什曼原蟲，L.braziliensis)是新世界分離株，為L.Viannia。

聯(lián)合分析國內(nèi)外60株利什曼原蟲的hsp70序列(見圖2)，結(jié)合Frage等5]和Sch?nian等[10]對(duì)利什曼原蟲分型的觀點(diǎn)，中國分離株聚集為L. (Leishmania)亞屬的L.donovani和L.major兩個(gè)種，其中A群為L.donovani，根據(jù)hsp70基因堿基差異，該群又分為A1、A2兩個(gè)亞群，A1亞群包含6株中國分離株和3株其他國家的杜氏利什曼原蟲指名亞種，A2亞群包含7株中國分離株和5株其他國家的杜氏利什曼原蟲嬰兒亞種； 我國的B群(L.turanica)和C群(L.gerbilli)為L.major，我國的D群為利什曼原蟲的另外一個(gè)亞屬L. (Sauroleishmania)。

圖129株利什曼原蟲的hsp70基因序列構(gòu)建的Neighbor-Joining無根樹

Fig.1Neighbor-joiningunrootedtreeconstructedbasedonthesequencesofhsp70genefor29Leishmaniaisolatesinthisstudy(23ChineseLeishmaniastrainsand6WHOreferencestrains)

The Kimura-2-parameter model in MEGA 5.0 was used. Numbers above branches correspond to bootstrap values based on 1 000 replicates. The strains were designated by their names.

3 討 論

利什曼病(leishmaniasis)對(duì)人類健康危害嚴(yán)重。在我國，本病曾流行于17個(gè)省、市、自治區(qū)，目前，平原疫區(qū)的山東和江蘇等地的利什曼原蟲已消除，但新疆喀什綠洲的利什曼病仍處于活躍狀態(tài)[11]；山丘疫區(qū)和荒漠疫區(qū)的利什曼病流行較嚴(yán)重，不斷有新感染病例出現(xiàn)[12]。我國不同流行疫區(qū)的利什曼病病原體有差異，有學(xué)者[13-14]以往根據(jù)黑熱病流行的地貌類型特點(diǎn)和傳染源種類將我國利什曼病流行區(qū)分為：平原型(人源型)、山丘型(犬源型)和荒漠型(野生動(dòng)物源型)，并且分別認(rèn)為平原型的蟲種為杜氏利什曼原蟲，山丘型和荒漠型的病原為嬰兒利什曼原蟲，但近年來國內(nèi)外許多研究認(rèn)為中國的利什曼原蟲種類更加復(fù)雜多樣[15]。熱休克蛋白70(hsp70)基因已廣泛應(yīng)用于多種寄生蟲的種系發(fā)育研究，因此本研究對(duì)利什曼原蟲分離株的hsp70基因進(jìn)行分析，研究我國利什曼原蟲分離株之間以及我國利什曼原蟲與世界其他流行區(qū)的利什曼原蟲之間的種系發(fā)育情況和進(jìn)化關(guān)系。

圖229株利什曼原蟲與GenBank下載的31株利什曼原蟲的lack基因序列構(gòu)建的Neighbor-Joining無根樹。

Fig.2Neighbor-joiningtreeconstructedbasedonthesequencesof29Leishmaniaisolates(23Chineseisolatesand6WHOreferenceisolates)inthisstudyand31isolateswhosesequencesweretakenfromGenBank

The Kimura-2-parameter model in MEGA 5.0 software was used. Bootstrap values based on 1 000 replicates are shown above in each branch. The strains were designated by their names for those in this study and by the accession numbers for those in other studies.

基于hsp70基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，中國各疫區(qū)利什曼原蟲分離株聚集為4群 (見圖1)，分別為A群杜氏利什曼原蟲 (L.donovani)，B群都蘭利什曼原蟲(L.turanica)，C群沙鼠利什曼原蟲(L.gerbilli)和D群蜥蜴利什曼原蟲(Sauroleishmania)，其中分離自人的蟲株均歸為杜氏利什曼原蟲。有研究指出[16]，宿主來源不同影響利什曼原蟲蟲株的系統(tǒng)發(fā)育，即利什曼病的發(fā)生與宿主有關(guān)，如在中國發(fā)現(xiàn)的L.turanica(B群)僅來自于沙鼠和白蛉，在國內(nèi)尚未見感染人的L.turanica。而從蜥蜴體內(nèi)分離的病原體為蜥蜴利什曼原蟲(D群)，這種蟲種跟宿主相關(guān)的流行病學(xué)特點(diǎn)可能受許多復(fù)雜因素的影響，目前這些因素尚未一一闡明。聯(lián)合比對(duì)分析本研究29株利什曼原蟲hsp70序列和基因數(shù)據(jù)庫中下載的31株世界其他流行區(qū)利什曼原蟲的hsp70序列，重建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖2。利什曼原蟲屬有三個(gè)亞屬：L. (Leishmania)，L. (Sauroleishmania)和L. (Viannia)。中國分離株有兩株為L. (Sauroleishmania)亞屬，其余蟲株均為L. (Leishmania)亞屬。在杜氏利什曼原蟲(L.donovani)中，hsp70基因?qū)⒅袊猜x分為兩個(gè)亞支：杜氏利什曼原蟲指名亞種(L.donovani)和杜氏利什曼原蟲嬰兒亞種(L.infantum)。分離自四川犬的原蟲(SC9)、甘肅人和犬的原蟲(8801、1101、1102)及分離自新疆喀什地區(qū)人的利什曼原蟲(801、KS6)為杜氏利什曼原蟲嬰兒亞種(L.infantum)，分離自四川人的原蟲(SC6)、山東人的原蟲(9044)及新疆人(皮膚利什曼病)和白蛉的利什曼原蟲(KXG-LIU、KXG-XU、771、KXG-65)為杜氏利什曼原蟲指名亞種(L.donovani)。新疆克拉瑪依的沙鼠和白蛉體內(nèi)分離出的蟲株為都蘭利什曼原蟲(L.turanica)，與國內(nèi)其他研究方法得出的結(jié)論一致[15]。都蘭利什曼原蟲和沙鼠利什曼原蟲的保蟲宿主為沙鼠，傳播媒介為白蛉，兩種原蟲的關(guān)系相近，因此在系統(tǒng)發(fā)育樹中，B群和C群的分支鄰近。

蟲株SC6和SC9分別分離自四川南坪的人和犬，二者均聚為L.donovani復(fù)合體，但仍因存在一定的差異而歸入兩個(gè)亞群(A1和A2)，在利什曼原蟲感染人和犬時(shí)，可能由于蟲株對(duì)人、犬的侵入和免疫逃避反應(yīng)不同，為適應(yīng)宿主而達(dá)到蟲體在宿主體內(nèi)感染的平衡狀態(tài)，病原體會(huì)發(fā)生一定的變異，從而導(dǎo)致SC6、SC9出現(xiàn)個(gè)別核苷酸序列的差異。但尚不清楚這種差異是否是一種穩(wěn)定的現(xiàn)象存在？需要更多來自四川疫區(qū)人和犬的利什曼原蟲分離株來證實(shí)。而Sun K等[17]通過7SL RNA序列得到的結(jié)論認(rèn)為分離自四川犬和人的利什曼原蟲為利什曼屬的未定種，該未定種的利什曼原蟲在系統(tǒng)發(fā)育樹中與蜥蜴利什曼原蟲最相近，與本研究的分型結(jié)果不同。本研究中僅有兩株四川的利什曼原蟲分離株(SC6、SC9)，由于不同的基因其側(cè)重的研究靶點(diǎn)不同，基因所受到的選擇壓力或基因漂移的作用不同，對(duì)利什曼原蟲的進(jìn)化史推測到的結(jié)果可能會(huì)有分歧，不能排除研究中基因選擇偏倚對(duì)分子分型的影響，因此需要研究更多來自四川疫區(qū)人和犬的利什曼原蟲分離株，聯(lián)合擴(kuò)增其多個(gè)保守基因，來證實(shí)分離自四川的利什曼原蟲的種屬情況。

本研究結(jié)果與以往國內(nèi)學(xué)者的結(jié)論有差異，以往研究學(xué)者是根據(jù)利什曼病流行區(qū)的地理景觀、流行特征和傳染源種類等特點(diǎn)將我國的利什曼原蟲進(jìn)行區(qū)分，而本文從分子水平上對(duì)蟲株進(jìn)行分類，分辨率高且快速簡便，有利于準(zhǔn)確查找傳染源頭，追蹤病原體的進(jìn)化過程，控制疾病的傳染。

參考文獻(xiàn)：

[1]Guan LR. Present situation of visceral leishmaniasis and prospect for its control in China[J]. Chin J Parasitol Parasit Dis, 2009, 27(5): 394-397. (in Chinese)

管立人. 我國內(nèi)臟利什曼病的現(xiàn)狀和對(duì)防治工作的展望[J]. 中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志, 2009, 27(5):394-397.

[2]Wang JY, Gao CH, Yang YT, et al. Evaluation of a repetitive DNA sequence ofLeishmaniaon the identification ofLeishmaniaisolates in China[J]. Chin J Zoonoses, 2005, 21(4): 304-308. (in Chinese)

汪俊云, 高春花, 楊玥濤, 等. 利什曼原蟲-DNA重復(fù)序列在蟲種鑒定上的價(jià)值分析[J]. 中國人獸共患病雜志, 2005, 21(4):304-308.

[3]Zhang T, Hu XS, Jing BQ, et al. Sequence analysis of SSUrDNA variable region fo cutaneous Leishmaniasis pathogen from Xinjiang, China[J]. Chin J Parasit Dis Ctrl, 1998, 11(4): 279-283. (in Chinese)

章濤, 胡孝素, 敬保遷, 等. 我國新疆皮膚利什曼病病原體SSU rDNA多變區(qū)序列分析[J]. 中國寄生蟲病防治雜志, 1998, 11(4):279-283.

[4]Chen JP, Hu XS, Zheng XL, et al. Study on the molecular hybridization in kDNA of 3Leishmaniaspecies and the pathogenic agent of Cutaneous leishmaniasis in Xinjiang, China[J]. Chin J Vect Biol Ctrl, 1997, 8(1): 54-57. (in Chinese)

陳建平, 胡孝素, 鄭學(xué)禮, 等. 三種利什曼原蟲和我國新疆皮膚利什曼原蟲kDNA分子雜交實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國媒介生物學(xué)及控制雜志, 1997, 8(1):54-57.

[5]Fraga J, Montalvo AM, De Doncker S, et al. Phylogeny ofLeishmaniaspecies based on the heat-shock protein 70 gene[J]. Infect Genet Evol, 2010, 10(2): 238-245. DOI: 10.1016/j.meegid.2009.11.007

[6]Montalvo AM, Fraga J, Monzote L, et al. Heat-shock protein 70 PCR-RFLP: a universal simple tool forLeishmaniaspecies discrimination in the New and Old World[J]. Parasitology, 2010, 137(8): 1159-1168. DOI: 10.1017/S0031182010000089

[7]Schonian G, Schweynoch C, Zlateva K, et al. Identification and determination of the relationships of species and strains within the genusLeishmaniausing single primers in the polymerase chain reaction[J]. Mol Biochem Parasitol, 1996, 77(1): 19-29.

[8]Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods[J]. Mol Biol Evol, 2011, 28(10): 2731-2739. DOI: 10.1093/molbev/msr121

[9]Posada D. jModelTest: phylogenetic model averaging[J]. Mol Biol Evol, 2008, 25(7): 1253-1256. DOI: 10.1093/molbev/msn083

[10]Schonian G, Mauricio I, Cupolillo E. Is it time to revise the nomenclature ofLeishmania?[J]. Trends Parasitol, 2010, 26(10): 466-469. DOI: 10.1016/j.pt.2010.06.013

[11]Tian T, Wu WP, Wang LY, et al. Epidemiological analysis on visceral leishmaniasis in China during 2008-2011[J]. Int J Med Parasit Dis, 2012, 39(4): 223-226. (in Chinese)

田添, 伍衛(wèi)平, 王立英, 等. 2008-2011年我國內(nèi)臟利什曼病流行病學(xué)分析[J]. 國際醫(yī)學(xué)寄生蟲病雜志, 2012, 39(4):223-226.

[12]Wang JY, Gao CH, Yang YT, et al. An outbreak of the desert sub-type of zoonotic visceral leishmaniasis in Jiashi, Xinjiang Uygur Autonomous Region, People's Republic of China[J]. Parasitol Int, 2010, 59(3): 331-337. DOI: 10.1016/j.parint.2010.04.002

[13]Lv HG, Zhong L, Guan LR, et al. Separation of ChineseLeishmaniaisolates into five genotypes by kinetoplast and chromosomal DNA heterogeneity[J]. Am J Trop Med Hyg, 1994, 50(6): 763-770.

[14]Wang JY, Qu JQ, Wang RQ. Analysis on homology in several isolates ofLeishmaniafrom Karamay, Xinjiang[J]. Chin J Parasitol Parasit Dis, 1996, 14(4): 266-269. (in Chinese)

汪俊云, 瞿靖琦, Rongqi Wang, 等. 新疆克拉瑪依地區(qū)幾株利什曼原蟲分離物的同源性分析[J].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志, 1996, 14(4):266-269.

[15]Yang BB, Guo XG, Hu XS, et al. Species discrimination and phylogenetic inference of 17 ChineseLeishmaniaisolates based on internal transcribed spacer 1 (ITS1) sequences[J]. Parasitol Res, 2010, 107(5): 1049-1065. DOI: 10.1007/s00436-010-1969-9

[16]Dujardin JC. Risk factors in the spread of leishmaniases: towards integrated monitoring?[J]. Trends Parasitol, 2006, 22(1): 4-6.

[17]Sun K, Guan W, Zhang JG, et al. Prevalence of canine leishmaniasis in Beichuan County, Sichuan, China and phylogenetic evidence for an undescribedLeishmaniasp. in China based on 7SL RNA[J]. Parasit Vectors, 2012, 5(1): 75. DOI: 10.1186/1756-3305-5-75