不同產地美花石斛內生細菌分離及促生潛力比較

童文君， 張 禮， 薛慶云， 侯北偉， 丁小余

(南京師范大學生命科學學院， 江蘇 南京 210023)

在植物的健康組織或器官內存在大量微生物，在不引起植物病變的同時這些微生物能與植物建立良好的相互合作關系，Petrini將這種在其生活史中某個階段或全部階段不會引起植物組織或器官明顯變化的細菌稱為植物內生細菌(endophyte bacteria)[1]。蘭科(Orchidaceae)植物與內生細菌存在著復雜的微生態(tài)關系，細菌可通過氣孔、皮孔及傷口等開放性結構進入植物組織，然后在植物組織間隙或細胞間質形成具有生態(tài)功能的群落，同時植物組織也可保護內生細菌免受紫外線或干燥等其他有害環(huán)境的傷害，從而保障內生細菌生存[2]。至今，已從90多種蘭科植物中分離出大量內生細菌，這些內生細菌對蘭科植物具有重要的生物學功能，如解磷、解鉀、分泌IAA、促進植物生長及抗植物病原菌等[3]。

石斛屬(DendrobiumSw.)為蘭科第2大屬， 包括 1 400多個種，主要分布于亞洲熱帶和亞熱帶地區(qū)、太平洋島嶼以及大洋洲[4]。目前中國已記載石斛屬植物81種2變種，其中18種為中國特有種[5]。近年來有關石斛屬內生細菌的研究已有報道，表明有些內生細菌菌株能直接促進石斛屬植物的生長。俞婕等[6]從鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)中分離到1株內生細菌SH1，將其發(fā)酵原液接種于鐵皮石斛組培苗的基部，其組培苗的生長速率明顯提高；Tsavkelova 等[7]從杓唇石斛〔Dendrobiummoschatum(Buch.-Ham.) Sw.〕氣生根內分離出大量可進行光合作用且為宿主提供氮素營養(yǎng)的內生細菌。因而，研究石斛內生細菌可為石斛生長和產量的提高等提供理論依據(jù)和技術支持。

美花石斛(DendrobiumloddigesiiRolfe)又名環(huán)草石斛、小環(huán)草和小黃草等，主要分布在廣西、廣東、貴州和云南等地，具有滋陰清熱、生津益胃、潤肺止咳等功效[8]。近年來，隨著市場需求的增加價格上漲，美花石斛被大量采挖，其野生資源遭到極大破壞。由于美花石斛在自然狀態(tài)下生長周期長、繁殖系數(shù)低，所以近年來主要采用組織培養(yǎng)技術實現(xiàn)其大量繁殖，但其組培苗移栽成活率低以及生長緩慢仍是阻礙美花石斛產業(yè)化的主要問題。朱國勝等[9]的研究結果表明：美花石斛生長緩慢主要是因為缺乏共生菌根真菌。但有關美花石斛內生細菌與其生長的關系鮮見研究。

作者以采自廣西、云南和廣東的美花石斛為研究對象，對其根、莖和葉中的可培養(yǎng)內生細菌進行分離，剔除重復菌株并通過16SrDNA序列測定和比對鑒定分離出的菌株，同時利用擴增核糖體DNA限制性酶切分析(amplified ribosomal DNA restriction analysis， ARDRA)方法對內生細菌菌株的多樣性進行分析[10-11]，并測定所有分離菌株的促生相關特性(包括解磷、解鉀和產生長素IAA能力)；在此基礎上，以既能解磷、解鉀又能產生長素的菌株作為促生實驗菌株，研究這些菌株對美花石斛試管苗的促生效應。以期為尋找與美花石斛生長相關的內生細菌、改善其人工生長環(huán)境提供平臺，并為美花石斛人工培育產業(yè)研發(fā)奠定理論和應用基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物采集及組培 供試的野生美花石斛植株于2011年至2012年采自廣西、云南和廣東，樣株編號分別為GX20120601—GX20120603、YN20111201—YN20111203和GD20111101—GD20111105，合計11株，均由南京師范大學生命科學學院丁小余教授鑒定，活體植株保存于南京師范大學生命科學學院植物資源與環(huán)境研究所。美花石斛試管苗由本課題組培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度21 ℃～25 ℃、光照度1 500 lx、光照時間12 h·d-1、空氣相對濕度60%～80%。

1.1.2 美花石斛內生細菌的分離、保存和活化 從11株美花石斛的根、莖和葉上分別取質量相等的樣品，共33份；稱取質量后用體積分數(shù)2.5% NaClO溶液浸泡10 min，并用無菌水淋洗3次(取最后1次淋洗液0.1 mL均勻涂于NA培養(yǎng)基[12]上，若48 h后無菌落出現(xiàn)則可確認表面消毒干凈)；將表面消毒后的植物樣品置于滅菌研缽中，加入相當于樣品質量9倍的滅菌水并研磨，分別取0.1 mL研磨液涂于NA培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫箱培養(yǎng)1～3 d，待菌落長出后根據(jù)菌落的形態(tài)進行純化；常溫下用水保存，同時用體積分數(shù)40%甘油保存于-80 ℃條件下。每份樣品設置3個重復。

所有菌株均用NA培養(yǎng)基活化。挑取常溫下用水保存或-80 ℃下用體積分數(shù)40%甘油保存的菌株，劃線分離培養(yǎng)，于28 ℃培養(yǎng)48 h；挑取單菌落至NA培養(yǎng)液中，于28 ℃、250 r·min-1培養(yǎng)24 h，備用。

1.2 方法

1.2.1 解磷能力測試 吸取待測菌液10 μL，分別滴到有機磷培養(yǎng)基(OPA)和無機磷培養(yǎng)基(NPA)[13]平板上，于28 ℃培養(yǎng)48 h；觀察NPA及OPA平板上透明菌圈的有無并測量菌圈半徑(cm)，每一菌株重復檢測3次。

1.2.2 解鉀能力測試 參照文獻[14]的方法配制含有鉀長石的培養(yǎng)基，吸取待測菌液10 μL，滴至鉀長石培養(yǎng)基平板上，于28 ℃培養(yǎng)72 h；觀察平板上有無形成透明光滑油滴，并統(tǒng)計能形成透明光滑油滴的菌株數(shù)量，每一菌株重復檢測3次。

1.2.3 產生長素能力測試 用含200 mg·L-1L-色氨酸的NA液體培養(yǎng)基，于28 ℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)菌液48 h；取1 mL菌懸液滴于白色瓷板上，并加1 mL Salkowski比色液[15]，對照組僅滴加1 mL比色液；將白色瓷板置于室溫條件下避光放置30 min后觀察其顏色變化，并記錄顏色變化強度，每一菌株重復檢測3次。

1.2.4 ARDRA分析 采用CTAB法[16]提取內生細菌DNA，利用細菌通用引物8f和1492r對內生細菌的16SrRNA片段進行擴增[17]；用AluI和MspI(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)2種限制性內切酶對16SrRNA擴增產物進行聯(lián)合酶切；取酶切后的樣品進行電泳，并在UVP凝膠成像系統(tǒng)上進行觀察[18]。

利用GelCompar Ⅱ軟件分析酶切產物圖譜。基于Pearson相關指數(shù)的相似性系數(shù)、采用UPGMA法(unweighted pair-group method using arithmetic averages)繪制聚類樹狀圖，具體參數(shù)如下：optimization(0.66%)； position tolerance(1.3%)； chance towards end of fingerprint(0%)；minimum height(0%)；minimum surface(0%)；uncertain bands(ignore)。以70.0%相似度為基準對菌株進行聚類分析；從菌株活化到酶切，對5個菌株進行重復，5個菌株相似度均大于70.0%則聚在一簇。

選取各ARDRA簇的代表菌株進行16SrDNA測序，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，獲得各菌株的分類鑒定結果。

1.2.5 試管苗促生潛力觀察 將既能解磷、解鉀又能產生長素的菌株接種到200 mL NA液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、250 r·min-1條件下培養(yǎng)至對數(shù)期，至菌液的OD600值約為1×108CFU·mL-1，用無菌NA培養(yǎng)液稀釋100倍備用。

取300株試管苗， 按照 3～4 cm、2～3 cm和1～2 cm株高分為3組，其中，株高3 cm試管苗分至第2組，株高2 cm試管苗分至第3組，每組100株。分別吸取1 mL稀釋菌液(1×106CFU·mL-1)添加至試管苗根部，對照組僅添加1 mL NA培養(yǎng)液；每組5個重復。將試管苗置于溫度(25±2) ℃、光照度1 500 lx、光照時間12 h·d-1、空氣相對濕度60%～80%的條件下培養(yǎng)，每隔10 d觀察1次，連續(xù)觀察2個月，分別記錄培養(yǎng)瓶中試管苗的株高和根長變化。

2 結果和分析

2.1 不同產地美花石斛內生細菌分布特征

分離結果顯示：從來源于廣西、云南及廣東3個產地的美花石斛根、莖和葉中分別分離獲得內生細菌菌株42、11及14株，共計67株內生細菌菌株。從分離部位看，分離自莖的菌株占總菌株數(shù)的51%(34株)，數(shù)量最多；分離自根的菌株占31%(21株)；分離自葉的菌株僅占18%(12株)，數(shù)量最少。

2.2 美花石斛內生細菌促生特性分析

2.2.1 解磷能力分析 測定結果顯示：在分離獲得的67株美花石斛內生細菌菌株中，有54株菌株能夠在OPA培養(yǎng)基(有機磷培養(yǎng)基)上產生明顯的透明菌圈，且菌圈半徑為0.3～1.6 cm。按產地劃分，其中有40株菌株分離自來源于廣西的植株，占74%；有9株菌株分離自來源于云南的植株，占16%；有5株菌株分離自來源于廣東的植株，占10%。按分離部位劃分，其中有50%(27株)的菌株分離自莖，30%(16株)的菌株分離自根，20%(11株)的菌株分離自葉。

可在NPA培養(yǎng)基(無機磷培養(yǎng)基)上產生明顯透明菌圈的有30株菌株。按產地劃分，其中90%(27株)分離自來源于廣西的植株，3%(1株)分離自來源于云南的植株，7%(2株)分離自來源于廣東的植株；按照分離部位劃分，其中47%(14株)分離自莖，30%(9株)分離自根，23%(7株)分離自葉。此外，所有能解無機磷的菌株均表現(xiàn)出解有機磷的特性。

2.2.2 解鉀能力分析 測定結果顯示：在分離獲得的67株美花石斛內生細菌菌株中，有22株菌株能形成透明的光滑油滴狀菌落，說明這些菌株具有解鉀能力。按產地劃分，其中68%(15株)分離自來源于廣西的植株，22%(5株)分離自來源于云南的植株，10%(2株)分離自來源于廣東的植株；按照分離部位劃分，其中64%(14株)分離自莖，36%(8株)分離自根，而分離自葉的菌株均無解鉀能力。

2.2.3 產生長素能力分析 測定結果顯示：在分離獲得的67株內生細菌菌株中，有24株菌株可使Salkowski比色液變紅，說明這些菌株具有產生長素能力。按照產地劃分，其中75%(18株)分離自來源于廣西的植株、17%(4株)分離自來源于云南的植株、8%(2株)分離自來源于廣東的植株；按照分離部位劃分，其中67%(16株)分離自莖，21%(5株)分離自根，12%(3株)分離自葉。

此外，在所有67株菌株中，有8株菌株同時兼具解無機磷、解有機磷、解鉀以及產生長素的特性，并且這些菌株均分離自來源于廣西的植株莖部。

2.3 美花石斛內生細菌多樣性分析

根據(jù)ARDRA分析結果，采用UPGMA法對67株內生細菌進行聚類分析，結果見圖1。聚類分析結果顯示：67株內生細菌共表現(xiàn)出50種不同的ARDRA譜型，根據(jù)70.0%的相似度劃分，67株菌株被分為31個ARDRA簇(圖1)。其中，僅包含1株菌株的ARDRA簇有18個， 而其他13個ARDRA簇則包含2株及2株以上的菌株。按照產地劃分，其中分離自廣西植株的42株菌株分屬于22個ARDRA簇，分離自云南植株的11株菌株分屬于5個ARDRA簇，分離自廣東植株的14株菌株分屬于7個ARDRA簇。最大的ARDRA簇(第12簇)包含3個產地的13株菌株，其中6株分離自莖；第二大簇(第3簇)包含分離自廣西植株根、莖和葉的9株菌株，其中5株菌株分離自根。

從31個ARDRA簇中分別選出1個代表性菌株，對其16SrDNA片段序列進行測序，并與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對，31個ARDRA簇代表性菌株的比對結果及促生特性見表1。結果顯示：分離獲得的67株內生菌株屬于12個屬，分別是假單胞菌屬(Pseudomonas)、微桿菌屬(Microbacterium)、腸桿菌屬(Enterobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、副球菌屬(Paracoccus)、泛菌屬(Pantoea)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、涅斯捷連科氏菌屬(Nesterenkonia)和沙雷氏菌屬(Serratia)。其中，芽孢桿菌屬、微桿菌屬和腸桿菌屬為美花石斛內生細菌的優(yōu)勢屬。芽孢桿菌屬在3個產地植株的根、莖和葉中均有分布，腸桿菌屬僅在廣西植株的根、莖和葉中有分布，鞘氨醇單胞菌屬僅分布于廣西植株的根中，葡萄球菌屬僅分布于廣西植株的葉中，嗜冷桿菌屬僅分布于廣東植株的莖中，副球菌屬僅分布于廣東植株的根中，涅斯捷連科氏菌屬僅分布于云南植株的根和莖中。

2.4 美花石斛內生細菌促生潛力分析

由表1可見：8株兼具3種促生特性的菌株分別隸屬于芽孢桿菌屬、腸桿菌屬和假單胞菌屬。因3個產地的植株中均分布有芽孢桿菌屬菌株，故將芽孢桿菌菌株DLB20作為促生實驗菌株。觀察結果顯示：當加入1×106CFU·mL-1DLB20后，菌落在培養(yǎng)基上生長緩慢，并逐漸與美花石斛試管苗形成穩(wěn)定的生長環(huán)境。接種10 d后，株高不同的3個實驗組的試管苗長勢均正常，培養(yǎng)基表面有少許菌落產生。接種30 d后，第3實驗組的試管苗根部細菌開始繁殖，植株開始萎蔫發(fā)黃；第1與第2實驗組的試管苗生長良好，長勢沒有明顯差異。接種60 d后，第3實驗組的植株死亡，第1與第2實驗組的試管苗長勢良好且株高無明顯區(qū)別，但第1實驗組試管苗的生根狀況優(yōu)于第2實驗組；3個對照組的試管苗均正常生長，但第1和第2對照組的試管苗長勢弱于實驗組。3個實驗組和3個對照組試管苗的生長狀況對比見圖2。

圖1 美花石斛67株內生細菌的ARDRA指紋圖譜及其聚類圖

表1 美花石斛內生細菌31個ARDRA簇代表菌株的特征信息

3 討論和結論

自20世紀80年代末以來，蘭科植物的內生細菌日益成為研究熱點。蘭科植物內生細菌種類非常豐富，在根、莖和葉中均有分布[19]，其中根和莖是常見的分離部位。例如，章華偉等[20]從鐵皮石斛中分離出23株內生細菌，其中莖中分布較多；Tsavkelova 等[21]的研究結果顯示：從杓唇石斛分離內生細菌，根部是常見的分離部位。本實驗結果顯示：美花石斛莖中所含的內生細菌最多，其次是根，也說明蘭科植物的根和莖是常見的分離部位。Chen等[22]的研究結果表明：美花石斛內生真菌隨產地差異表現(xiàn)出一定的特異性，本實驗結果也顯示美花石斛內生細菌與其內生真菌同樣具有地區(qū)特異性。

1-3. 實驗組Experimental group: 1. 株高3～4 cm試管苗 Plantlets with height of 3-4 cm； 2. 株高2～3 cm試管苗 Plantlets with height of 2-3 cm; 3. 株高1～2 cm試管苗 Plantlets with height of 1-2 cm. C1-C3. 對照組Control group: C1. 株高3～4 cm試管苗 Plantlets with height of 3-4 cm； C2. 株高2～3 cm試管苗 Plantlets with height of 2-3 cm; C3. 株高1～2 cm試管苗 Plantlets with height of 1-2 cm.

蘭科植物內生細菌優(yōu)勢屬是指宿主組織內出現(xiàn)頻率較高的屬。Wilkinson等[23-25]認為：假單胞菌屬是地生蘭的優(yōu)勢屬，其次是芽孢桿菌屬、庫特氏菌屬(Kurthia)和節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)。在有關的研究中芽孢桿菌也被證實為杓唇石斛[26]和流蘇石斛(DendrobiumfimbriatumHook.)[27]內生細菌的優(yōu)勢屬。本實驗結果顯示：美花石斛內生細菌優(yōu)勢屬包括芽孢桿菌屬、微桿菌屬和腸桿菌屬，其中芽孢桿菌屬在來源于3個產地的植株內均為優(yōu)勢屬，腸桿菌屬僅存在于來源于廣西的美花石斛植株中，且來源于廣西的植株中優(yōu)勢屬的種類和數(shù)量都比來源于云南和廣東的植株豐富，與來源于廣西的美花石斛樣品新鮮程度較佳有關。這一研究結果也證實了Wilkinson 等[24]關于“蘭科植物內生細菌優(yōu)勢屬會隨地區(qū)、季節(jié)，尤其是基于菌根真菌侵染的組織形態(tài)學的不同而發(fā)生變化，且不同地區(qū)表現(xiàn)出差異性”的結論。

磷和鉀都是植物生長必不可少的營養(yǎng)元素，利用解磷和解鉀的內生細菌轉化環(huán)境中的磷和鉀是改善植物生長的首選方法之一[28]。生長素IAA可以通過增加根的生長促進植物生長和分化，還可促進根毛增殖和延長，有利于根從土壤中吸收更多的營養(yǎng)物質[29]。通常，促生實驗依據(jù)內生細菌菌株解磷、解鉀、產生長素的能力來衡量其促生潛力，而本實驗結果證實具有促生潛力的美花石斛內生細菌菌株可以促進其試管苗的生長。

細菌的濃度是影響促生效果的關鍵因子，低濃度(1×105CFU·mL-1)具有促生效果，而高濃度則可能對植物有不利影響[30]，這可能與“細菌濃度過高會破壞植物或部分組織，從而引起植物生長不良甚至死亡”有關?；谝陨显?，作者從能解磷、解鉀又能產IAA的8個美花石斛內生細菌菌株中選擇用于促生實驗的菌株，考慮到芽孢桿菌屬是美花石斛內生細菌中分布最廣泛的優(yōu)勢屬，所以將芽孢桿菌DLB20菌株選為測試菌株。實驗結果表明：1×106CFU·mL-1DLB20可以促進株高3～4 cm的美花石斛試管苗生長及生根，但導致株高1～2 cm試管苗死亡，表明植物內生細菌的促生效果與細菌的接種濃度和植株長勢有關。Aspray等[31]認為：細菌僅在一定濃度范圍內具有促生作用，不同細菌的促生濃度范圍存在差異。因此，確定內生細菌的適宜接種濃度對有效提高其促生效果有重要作用[32]。此外，F(xiàn)rey-Klett等[30]認為：蘭科植物在不同的生長階段可能與不同的菌株共生。因此，從成年植株根內分離的菌株對蘭科植物不同生長階段植株的促生作用有差異。

由于內生細菌的數(shù)量及種類與植物的產地密切相關，因而，建議擴大采樣數(shù)量和采樣地點對美花石斛內生細菌進行更為廣泛的分離和篩選。有關美花石斛內生細菌種類還需要采用分子生物學手段和生理生化實驗進一步鑒定。

參考文獻:

[1] PETRINI O. Fungal endophytes of tree leaves[M]∥ANDREWS J H, HIRANO S S. Microbial Ecology of Leaves. New York: Springer-Verlag, 1991: 179-197.

[2] LODEWYCKX C, VANGRONSVELD J, PORTEOUS F, et al. En-dophytic bacteria and their potential applications[J]. Critical Reviews in Plant Sciences, 2002, 21(6): 583-606.

[3] 胡 萌. 植物內生細菌研究進展[J]. 山東農業(yè)大學學報: 自然科學版, 2008, 39(1): 148-151.

[4] LAVARACK P S, HARRIS W, STOCKER G.Dendrobiumand Its Relatives[M]. Portland: Timber Press, 2000.

[5] ZHU G H, JI Z H, WOOD J J, et al.Dendrobium[M]∥WU Z Y, RAVEN P H, HONG D Y. Flora of China: Vol.25. Beijing: Science Press, 2009: 367-397.

[6] 俞 婕, 趙凱鵬, 董 飛, 等. 野生鐵皮石斛內生菌的分離及促生作用研究[J]. 現(xiàn)代農業(yè)科技, 2010(9): 96-97.

[7] TSAVKELOVA E A, LOBAKOVA E S, KOLOMEITSEVA G L, et al. Associative cyanobacteria isolated from the roots of epiphytic orchids[J]. Microbiology, 2003, 72(1): 92-97.

[8] 張光濃, 畢志明, 王崢濤, 等. 石斛屬植物化學成分研究進展[J]. 中草藥, 2003, 34(6): 附5-附8.

[9] 朱國勝, 劉作易, 黃永會, 等. 美花石斛組培苗促生內生真菌分離及篩選[J]. 種子, 2007, 26(12): 17-20.

[10] FULTHORPE R R, RHODES A N, TIEDJE J M. High levels of endemicity of 3-chlorobenzoate-degrating soil bacteria[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64(5): 1620-1627.

[11] CHO J C, TIEDJE J M. Biogeography and degree of endemicity of fluorescentPseudomonasstrains in soil[J]. Applied and Environ-mental Microbiology, 2000, 66(12): 5448-5456.

[12] 沈 萍, 范秀容, 李廣武. 微生物學實驗[M]. 3版. 北京: 高等教育出版社, 1999: 214-215.

[13] ZHENG Y, XUE Q Y, XU L L, et al. A screening strategy of fungal biocontrol agents towardsVerticilliumwilt of cotton[J]. Biological Control, 2011, 56(3): 209-216.

[14] 楊 柳, 唐旺全, 蔣 艷, 等. 解鉀芽孢桿菌的分離·鑒定及其代謝產物分析[J]. 安徽農業(yè)科學, 2011, 39(28): 17265-17267.

[15] GLICKMANN E, DESSAUX Y. A critical examination of the speci-ficity of the Salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria[J]. Applied and Environmental Micro-biology, 1995, 61(2): 793-796.

[16] DOYLE J J, DOYLE J L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissues[J]. Phytochemical Bulletin, 1987, 19: 11-15.

[17] CHELIUS M K, TRIPLETT E W. The diversity of archaea and bacteria in association with the roots ofZeamaysL.[J]. Microbial Ecology, 2001, 41(3): 252-263.

[18] 張曉霞, 馬曉彤, 曹衛(wèi)東, 等. 紫云英根瘤菌的系統(tǒng)發(fā)育多樣性[J]. 應用與環(huán)境生物學報, 2010, 16(3): 380-384.

[19] 張 萍, 宋希強. 蘭科植物內生細菌物種多樣性及其促生機理研究進展[J]. 熱帶亞熱帶植物學報, 2012, 20(1): 92-98.

[20] 章華偉, 鐘超群. 鐵皮石斛內生細菌的分離和初步鑒定[J]. 湖南農業(yè)科學, 2013, 52(8): 1811-1813.

[21] TSAVKELOVA E A, CHERDYNTSEVA T A, BOTINA S G, et al. Bacteria associated with orchid roots and microbial production of auxin[J]. Microbiological Research, 2007, 162(1): 69-76.

[22] CHEN X M, DONG H L, HU K X, et al. Diversity and anti-microbial and plant-growth-promoting activities of endophytic fungi inDendrobiumloddigesiiRolfe[J]. Journal of Plant Growth Regulation, 2010, 29(3): 328-337.

[23] WILKINSON K G, DIXON K W, SIVASITHAMPARAM K. Inter-action of soil bacteria, mycorrhizal fungi and orchid seed in relation to germination of Australian orchids[J]. New Phytologist, 1989, 112(3): 429-435.

[24] WILKINSON K G, DIXON K W, SIVASITHAMPARAM K, et al. Effect of IAA on symbiotic germination of an Australian orchid and its production by orchid-associated bacteria[J]. Plant and Soil, 1994, 159(2): 291-295.

[25] WILKINSON K G, DIXON K W, BRADLEY J K, et al. Identi-fication and characterization of bacteria associated with western Australian orchids[J]. Soil Biology and Biochemistry, 1994, 26(1): 137-142.

[26] TSAVKELOVA E A, CHERDYNTSEVA T A, NETRUSOV A I. Bacteria associated with the roots of epiphytic orchids[J]. Microbiology, 2004, 73(6): 710-715.

[27] TSAVKELOVA E A, CHERDYNTSEVA T A, KLIMOVA S Y, et al. Orchid-associated bacteria produce indole-3-acetic acid, promote seed germination, and increase their microbial yield in response to exogenous auxin[J]. Archives of Microbiology, 2007, 188(6): 655-664.

[28] ADESEMOYE A O, KLOEPPER J W. Plant-microbes interactions in enhanced fertilizer-use efficiency[J]. Applied Microbiology Biotechnology, 2009, 85(1): 1-12.

[30] FREY-KLETT P, CHURIN J L, PIERRAT J C, et al. Dose effect in the dual inoculation of an ectomycorrhizal fungus and a mycorrhiza helper bacterium in two forest nurseries[J]. Soil Biology and Biochemistry, 1999, 31(11): 1555-1562.

[31] ASPRAY T J, JONES E E, WHIPPS J M, et al. Importance of mycorrhization helper bacteria cell density and metabolite localization for thePinussylvestris-Lactariusrufussymbiosis[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2006, 56(1): 25-33.

[32] LIU P, NESTER E W. Indoleacetic acid, a product of transferred DNA, inhibitsvirgene expression and growth ofAgrobacteriumtumefaciensC58[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2006, 103(12): 4658-4662.