鐘小仙，劉智微，劉偉國(guó)，崔莉莉，吳娟子，張建麗

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，江蘇 南京210014）

狼尾草屬（Pennisetum）隸屬于禾本科，全世界約有130個(gè)種，廣泛分布于熱帶、亞熱帶和部分溫帶地區(qū)，一年生二倍體美洲狼尾草（Pennisetumamericanum；2n＝2x＝14，AA）和多年生四倍體象草（P.purpureum；2n＝4x＝28，AABB）是其中最重要的2個(gè)種［1］。美國(guó)喬治亞州立大學(xué)Tifton試驗(yàn)站自20世紀(jì)40年代開(kāi)始雜交狼尾草品種選育［2］，利用美洲狼尾草不育系與象草恢復(fù)系遠(yuǎn)緣雜交獲得了三倍體雜交狼尾草，能綜合母本美洲狼尾草品質(zhì)優(yōu)和父本象草產(chǎn)草量高、抗逆性強(qiáng)、可多年生的特性［3－4］。雜交狼尾草不僅可作為草食畜禽的優(yōu)質(zhì)青飼料，優(yōu)質(zhì)紙漿和人造板原料，還是重要的生物質(zhì)能源作物［5－8］。但由于父本象草為光周期敏感型短日照作物，自然開(kāi)花期在美國(guó)大部分地區(qū)因霜凍危害，無(wú)法完成大面積雜交制種或種子產(chǎn)量極低，Tifton試驗(yàn)站迄今尚未實(shí)現(xiàn)商品化種子生產(chǎn)。通過(guò)秋水仙素處理進(jìn)行染色體加倍、結(jié)合集團(tuán)選擇或回交選育能種子繁殖、綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的六倍體或四倍體雜交狼尾草，被認(rèn)為是一種恢復(fù)雜交狼尾草育性和進(jìn)行商品化種子生產(chǎn)的可能途徑，美國(guó)、巴西、印度等國(guó)已取得了初步的進(jìn)展［9－12］。江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)院20世紀(jì)80年代從美國(guó)引進(jìn)了雜交狼尾草品種及其親本材料，經(jīng)過(guò)多年的系統(tǒng)研究，盡管建立了“人工短日照處理誘導(dǎo)象草開(kāi)花并與美洲狼尾草不育系花期相遇”制種體系，率先突破了北緯26°以北地區(qū)不能雜交制種的生態(tài)禁區(qū)，但近年來(lái)災(zāi)害性天氣發(fā)生頻繁，父母本花期相遇不穩(wěn)定，制種產(chǎn)量低、風(fēng)險(xiǎn)大［13－14］，亟需嘗試雜交狼尾草大面積商品化種子生產(chǎn)的其他途徑，特別是耐鹽“蘇牧2號(hào)”象草2010通過(guò)全國(guó)牧草品種審定后［15］，創(chuàng)造耐鹽六倍體雜交狼尾草新種質(zhì)，并與美洲狼尾草雜交選育四倍體耐鹽雜交狼尾草成為近期育種的又一目標(biāo)。

本文以六倍體雜交狼尾草體細(xì)胞突變體CHP2009－14為材料，耐鹽雜交狼尾草（美洲狼尾草Tift23A×蘇牧2號(hào)象草）為對(duì)照，通過(guò)綜合農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)和飼用價(jià)值比較、葉片微形態(tài)特性分析和流式細(xì)胞術(shù)鑒定，以期明確六倍體耐鹽雜交狼尾草新種質(zhì)的特異性，為四倍體雜交狼尾草新品種選育提供參考，有關(guān)研究國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

大田試驗(yàn)在大豐市金海農(nóng)場(chǎng)試驗(yàn)基地進(jìn)行。試驗(yàn)地土壤為輕質(zhì)沙壤，有機(jī)質(zhì)、堿解氮、速效磷含量分別為16.8g/kg，31.2mg/kg，22.35mg/kg，pH 8.1，含鹽量為3.6g/kg。

1.2 試驗(yàn)材料

雜交狼尾草（CK）：美洲狼尾草不育系Tift23A×蘇牧2號(hào)象草，2n＝3x＝21，為三倍體；CHP2009－14：2007年，以對(duì)照雜交狼尾草幼穗離體培養(yǎng)獲得的胚性愈傷組織為材料，經(jīng)500mg/L秋水仙素誘導(dǎo)72h獲得的體細(xì)胞突變體，2n＝6x＝42，為六倍體耐鹽雜交狼尾草體細(xì)胞突變體。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 體細(xì)胞再生植株大田綜合農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)分析 2011年5月10日，把冬季塑料大棚保存的CHP2009－14和對(duì)照雜交狼尾草種莖移栽至大田，畦寬4m，行株距為45cm×40cm，每小區(qū)10行，每行8株，小區(qū)面積為16m2，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)。移栽前施無(wú)機(jī)復(fù)合肥（N∶P∶K＝10∶8∶7）750kg/hm2作基肥，苗期追施尿素75kg/hm2。

2011年8月1日，對(duì)植株綜合農(nóng)藝性狀進(jìn)行定性觀察后，每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選取5株測(cè)量株高（從地面至植株的最高部位的絕對(duì)高度），計(jì)算其平均值；每個(gè)小區(qū)各隨機(jī)選取10株，測(cè)量主莖倒數(shù)第3張完全展開(kāi)葉的長(zhǎng)度和寬度，計(jì)算平均值；選取葉片中間區(qū)域、主脈左右厚度均勻的部位，打孔器取葉片小樣，用游標(biāo)卡尺測(cè)量20片小樣的中心處厚度，計(jì)算其平均值，并測(cè)定葉片葉綠素含量［16］；選取中間8行進(jìn)行刈割測(cè)產(chǎn)，刈割留茬高度為15cm，取約1kg樣品莖葉分離后，75℃烘干測(cè)定含水量，計(jì)算干物質(zhì)產(chǎn)量，并進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)分析，粗蛋白、酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維、粗灰分的測(cè)定參照Van Soest纖維測(cè)定法［17］，體外干物質(zhì)消化率（IVDMD）采用Goto胃蛋白酶－纖維素酶兩步消化法測(cè)定［18］，刈割后田間統(tǒng)計(jì)中間6行植株的平均分蘗數(shù)。

1.3.2 葉片表皮微形態(tài)結(jié)構(gòu)分析 2011年7月28日，每個(gè)小區(qū)分別選取2個(gè)供試材料各1株，切取其倒數(shù)第3張完整葉片的中間區(qū)域（長(zhǎng)1cm、寬為葉片自然寬度），浸泡在30%過(guò)氧化氫∶醋酸（v∶v＝1∶1）溶液中，在60℃烘箱內(nèi)放置2～4h，待葉肉組織和表皮細(xì)胞分離后取出，放入裝有適量蒸餾水的培養(yǎng)皿中，用鑷子分離葉片上、下表皮，1%番紅染色3～6min，制成臨時(shí)裝片，在OLYMPUS CX31光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。采用形態(tài)學(xué)（熒光）圖像分析系統(tǒng)1.0軟件（JD801，江蘇捷達(dá)軟件工程有限公司，南京）測(cè)量如下各項(xiàng)指標(biāo)。

氣孔器密度：在10×10倍的物鏡下，每份材料選擇30個(gè)清晰視野拍照，計(jì)數(shù)氣孔器數(shù)目，測(cè)量視野中表皮面積，計(jì)算密度。

氣孔器長(zhǎng)度、寬度及面積：在10×40倍物鏡下，每份供試材料選取15個(gè)視野，每個(gè)視野隨機(jī)測(cè)量2個(gè)氣孔器的長(zhǎng)度、寬度和面積。由于取樣后氣孔處于關(guān)閉的狀態(tài)，試驗(yàn)測(cè)得的氣孔器長(zhǎng)度和寬度是指氣孔關(guān)閉狀態(tài)下啞鈴型氣孔器的長(zhǎng)度、寬度以及面積［19］。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)分析 2011年8月5日，各小區(qū)選取供試材料各1株刈割后再生的幼嫩葉片20～30mg，用刀片迅速切碎，放入加有1mL LB01緩沖液（15mmol/L Tris－HCl，2mmol/L Na2EDTA，80mmol/L KCl，20 mmol/L NaCl，0.5mmol/L spermine，15mmol/L mercaptoethanol，0.1%Triton X－100，pH 9.0）的培養(yǎng)皿（培養(yǎng)皿置于冰袋上）中，用移液槍將混合液吸打2～3次，經(jīng)二層400目（38μm）尼龍網(wǎng)過(guò)濾，濾液收集至1.5mL的離心管中，4℃、2000r/min離心3min，棄上清液，加入200μL LB01緩沖液，輕輕振蕩細(xì)胞重新懸浮，加入25μL的碘化丙啶（1mg/mL）進(jìn)行染色，并加入5μL RNase（1mg/mL），4℃、避光染色約1h后，轉(zhuǎn)入標(biāo)準(zhǔn)上樣管中，采用美國(guó)BD公司的FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定，使用隨機(jī)軟件Cellquest Pro獲取數(shù)據(jù)，采用Flowjo 7.5軟件做細(xì)胞周期分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，SPSS 16.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 綜合農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)和品質(zhì)分析

與對(duì)照三倍體雜交狼尾草相比，六倍體新種質(zhì)CHP2009－14株型緊湊，葉色深綠，葉綠素含量比對(duì)照提高10.51%（P＜0.05），葉片變短變厚，莖節(jié)縮短，葉片和葉鞘上絨毛增多，花藥無(wú)花粉散出，聯(lián)苯胺－過(guò)氧化氫反應(yīng)液能將CHP2009－14的白色柱頭染成深藍(lán)色并伴有大量氣泡出現(xiàn)，表明柱頭具有可授性。六倍體雜交狼尾草新種質(zhì)CHP2009－14的株高與對(duì)照三倍體雜交狼尾草相比降低了26.34% （P＜0.01），葉片長(zhǎng)度減少了20.06%（P＜0.01），葉片厚度增加了16.41% （P＜0.01），莖葉比減少了43.61% （P＜0.01），分蘗數(shù)提高44.62% （P＜0.01），葉片寬度CHP2009－14與對(duì)照差異不顯著（表1）。

與對(duì)照三倍體雜交狼尾草相比，六倍體雜交狼尾草新種質(zhì)CHP2009－14體外消化率顯著提高6.94% （P＜0.05），粗蛋白含量和灰分含量分別極顯著提高62.34% （P＜0.01）和17.35% （P＜0.01），中性洗滌纖維含量和酸性洗滌纖維含量分別降低3.35% （P＞0.05）和提高0.50% （P＞0.05），差異不顯著。六倍體雜交狼尾草新種質(zhì)CHP2009－14的鮮草產(chǎn)量比對(duì)照提高0.87% （P＞0.05），但由于六倍體雜交狼尾草新種質(zhì)植株的含水量低于對(duì)照，干物質(zhì)產(chǎn)量比對(duì)照低3.27% （P＞0.05），差異均未達(dá)到顯著水平（表2）。

表1 六倍體CHP2009－14與三倍體雜交狼尾草（CK）生物學(xué)特性比較Table 1 Comparison of biological characteristics in hexaploid CHP2009－14and triploid hybrid Pennisetum

表2 六倍體新種質(zhì)CHP2009－14與三倍體對(duì)照雜交狼尾草生物產(chǎn)量和品質(zhì)比較Table 2 Comparison of biomass and animal nutrition in hexaploid CHP2009－14and triploid hybrid Pennisetum

2.2 葉片表皮微形態(tài)特異性分析

雜交狼尾草新種質(zhì)CHP2009－14與對(duì)照葉片上、下表皮均由氣孔器、長(zhǎng)細(xì)胞（L）、短細(xì)胞（S）、葉脈和刺毛（T）等組成，脈間長(zhǎng)細(xì)胞多為長(zhǎng)形，細(xì)胞壁多具齒紋，短細(xì)胞及氣孔器分布于長(zhǎng)細(xì)胞間，氣孔器成行分布于葉脈間隙（圖1）。

與對(duì)照三倍體雜交狼尾草相比，六倍體雜交狼尾草新種質(zhì)CHP2009－14上表皮氣孔器密度減小了65.20%（P＜0.01），氣孔器長(zhǎng)度和寬度分別增加了47.71%（P＜0.01）和51.54%（P＜0.01）；下表皮氣孔器密度減小了35.71%（P＜0.01），其氣孔器長(zhǎng)度和寬度分別增加了30.53%（P＜0.01）和34.17%（P＜0.01）；雜交狼尾草新種質(zhì)CHP2009－14葉片上、下表皮氣孔器面積均較對(duì)照雜交狼尾草有所增加，分別達(dá)到對(duì)照雜交狼尾草氣孔器面積的2.07倍和1.54倍（表3）。

圖1 CHP2009－14與三倍體雜交狼尾草葉片上下表皮氣孔特性比較Fig.1 Comparison of stoma characteristics in upper and lower leaf epidermis of CHP2009－14and triploid hybrid Pennisetum

表3 六倍體CHP2009－14與三倍體雜交狼尾草葉片表皮氣孔器特征Table 3 Stoma characteristics in upper and lower leaf epidermis of CHP2009－14and hybrid Pennisetum

2.3 流式細(xì)胞術(shù)分析

以三倍體雜交狼尾草為對(duì)照，調(diào)整儀器閾值使對(duì)照三倍體雜交狼尾草G1期峰值所在的熒光道數(shù)為200道，檢測(cè)三倍體雜交狼尾草和六倍體雜交狼尾草新種質(zhì)CHP2009－14植株細(xì)胞核的DNA相對(duì)含量。結(jié)果顯示（圖2），三倍體雜交狼尾草G1期峰值位于200道附近，G2期峰值位于400道附近；新種質(zhì)CHP2009－14植株的G1、G2期峰值分別位于400道和800道附近，表示其細(xì)胞核DNA含量為對(duì)照三倍體雜交狼尾草的兩倍，雜交狼尾草新種質(zhì)CHP2009－14的染色體與對(duì)照相比發(fā)生了加倍。

3 討論與結(jié)論

3.1 六倍體雜交狼尾草種質(zhì)創(chuàng)新及評(píng)價(jià)

圖2 雜交狼尾草體細(xì)胞突變體對(duì)照 （A）和CHP2009－14（B）葉片相對(duì)DNA含量分布曲線Fig.2 Distribution curve of relative DNA content of somatic mutant CK （A）and CHP2009－14（B）in leaf

多年來(lái)，人工誘導(dǎo)多倍體的研究一直吸引著廣大的植物育種工作者［20］。但大量的研究發(fā)現(xiàn)，多倍化的種質(zhì)在形態(tài)、細(xì)胞學(xué)特性和分子特性方面發(fā)生的變異是多樣而復(fù)雜的［21－22］，人工誘導(dǎo)六倍體雜交狼尾草的研究國(guó)外有少量報(bào)道。Rajasekaran等［23］以不育系Tift23DA（2n＝2x＝14）×矮生象草品種‘N75’（2n＝4x＝28）雜交種幼穗為外植體，離體培養(yǎng)獲得的胚性愈傷為材料，在適宜激素組合的培養(yǎng)基中繼代和分化培養(yǎng)后的再生植株中，獲得了2株可自交結(jié)實(shí)的突變體植株，經(jīng)根尖染色體計(jì)數(shù)分析，染色體數(shù)2n＝6x＝42，為六倍體雜交狼尾草突變體植株，但對(duì)突變體產(chǎn)生機(jī)理尚不清楚，推測(cè)可能原始外植體為嵌合體，也可能與組織培養(yǎng)過(guò)程有關(guān)，對(duì)2個(gè)可自交結(jié)實(shí)的六倍體雜交狼尾草突變體的植物學(xué)特征評(píng)價(jià)表明，2個(gè)六倍體雜交狼尾草株高均極顯著低于對(duì)照三倍體雜交狼尾草，葉片寬度大于等于對(duì)照，而葉片長(zhǎng)度表現(xiàn)不一，1個(gè)比對(duì)照長(zhǎng)，1個(gè)比對(duì)照短。Hanna［10］利用秋水仙素處理三倍體雜交狼尾草幼苗根獲得了可自交結(jié)實(shí)的六倍體雜交狼尾草，Hanna等［24］對(duì)狼尾草屬次級(jí)基因庫(kù)中向初級(jí)基因庫(kù)中遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移的研究表明，以雌雄蕊均可育的六倍體雜交狼尾草為母本或父本與美洲狼尾草雜交均可產(chǎn)生種子，實(shí)現(xiàn)次級(jí)基因庫(kù)中的象草遺傳物質(zhì)向美洲狼尾草轉(zhuǎn)移。本研究中的六倍體雜交狼尾草新種質(zhì)CHP2009－14，是以三倍體雜交狼尾草（Tift 23A×蘇牧2號(hào)象草）的幼穗為材料，離體培養(yǎng)獲得的胚性愈傷為外植體，在繼代培養(yǎng)基中經(jīng)500mg/L秋水仙素誘導(dǎo)處理72h，分化培養(yǎng)后獲得的染色體加倍植株。與對(duì)照三倍體雜交狼尾草相比，株高極顯著降低、葉片長(zhǎng)度極顯著減小、分蘗數(shù)和葉片厚度極顯著增加，葉片寬度與對(duì)照無(wú)顯著差異，莖葉比極顯著減小；六倍體雜交狼尾草新種質(zhì)CHP2009－14具有多年生習(xí)性，盡管花藥敗育，不能自交結(jié)實(shí)，但柱頭具有可授性，正在篩選合適的二倍體美洲狼尾草恢復(fù)系與之雜交選育四倍體雜交狼尾草新品系，有關(guān)研究結(jié)果將進(jìn)一步報(bào)道。

Hanna等［25］研究了倍性對(duì)雜交狼尾草產(chǎn)量和品質(zhì)的影響，認(rèn)為多倍體對(duì)產(chǎn)量和品質(zhì)沒(méi)有影響或有負(fù)面影響，三倍體雜交狼尾草比六倍體雜交狼尾草具有更高的產(chǎn)量和品質(zhì)。本研究結(jié)果表明，在海涂地種植的新種質(zhì)CHP2009－14鮮草產(chǎn)量略高于三倍體雜交狼尾草，干物質(zhì)產(chǎn)量略低于對(duì)照，差異不顯著，體外消化率顯著增加，粗蛋白含量極顯著提高。本試驗(yàn)結(jié)果與Hanna等［25］的研究結(jié)果不一致，分析原因可能與種植的土地類型有關(guān)，CHP2009－14在鹽堿地種植表現(xiàn)優(yōu)于三倍體雜交狼尾草，有關(guān)機(jī)理正在進(jìn)一步研究。

3.2 六倍體雜交狼尾草新種質(zhì)的鑒定方法

Hodgson等［26］提出在被子植物相當(dāng)大范圍的分類單元里氣孔的大小與基因組大小呈正相關(guān)關(guān)系。Campos等［12］對(duì)獲得的17株六倍體植株、115株嵌合體植株的氣孔器特性分析表明，六倍體雜交狼尾草上下表皮氣孔器密度比三倍體雜交狼尾草減小了大約48.83%和44.83%，氣孔器面積約是三倍體雜交狼尾草的1.52倍，混倍體植株氣孔器密度和大小介于三倍體和六倍體之間。本研究結(jié)果表明，上下表皮氣孔器密度六倍體雜交狼尾草新種質(zhì)CHP2009－14比三倍體雜交狼尾草減小65.2%和35.71%，CHP2009－14葉片上、下表皮氣孔器面積分別為對(duì)照三倍體雜交狼尾草氣孔器面積的2.07倍和1.54倍，與Campos等［12］的研究結(jié)果呈現(xiàn)相似的規(guī)律。盡管多倍體育種中根尖染色體計(jì)數(shù)是最直接的倍性鑒定證據(jù)，但由于染色體精確計(jì)數(shù)對(duì)操作技術(shù)要求極高［27］，對(duì)染色體數(shù)多的嵌合體不易識(shí)別，而流式細(xì)胞術(shù)可靈敏地檢測(cè)出嵌合體并計(jì)算不同倍性細(xì)胞所占比例［28］。本研究中流式細(xì)胞術(shù)的分析結(jié)果表明，對(duì)照三倍體雜交狼尾草有絲分裂G1期和G2期的峰值在200和400附近，而CHP2009－14有絲分裂G1期和G2期的峰值在400和800附近，表明CHP2009－14細(xì)胞核DNA含量約是對(duì)照三倍體雜交狼尾草的2倍，與CHP2009－14的染色體計(jì)數(shù)結(jié)果2n＝42相吻合。因此，在秋水仙素誘導(dǎo)處理三倍體雜交狼尾草胚性愈傷再生植株后，可以先進(jìn)行葉片氣孔器特性分析初步篩選，然后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，最后進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)確定，可提高六倍體雜交狼尾草新種質(zhì)篩選的效率。

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