侯志帥 溫海深 尹相菡

(中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室, 青島 266003)

殼聚糖-HCG緩釋制劑對魚類生殖內(nèi)分泌機能的影響

侯志帥 溫海深 尹相菡

(中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室, 青島 266003)

以殼聚糖為原料制備殼聚糖-HCG緩釋制劑, 進行激素埋植實驗, 間隔一定時間檢測雌和雄魚性腺發(fā)育、血清主要性激素含量和繁殖內(nèi)分泌相關(guān)基因表達(dá)特征。結(jié)果表明: 在埋植殼聚糖-HCG緩釋激素后, 雌魚性成熟系數(shù)(GSI)、血清睪酮(T)水平、血清雌二醇(E2)水平在6—30d內(nèi)較對照組效果明顯; 雄魚GSI僅在第6天顯著高于對照組, 血清T水平在第2、第14天高于對照組。血清E2水平在實驗期間與對照組無顯著差異。RT-PCR結(jié)果顯示: 性腺型P450芳香化酶(CYP19A)在性腺中表達(dá)豐富, 心臟中最少。雌魚性腺P450芳香化酶(CYP19A)基因mRNA相對表達(dá)量在第2、第6天顯著高于對照組, 雄魚在第6天顯著高于對照, 雌魚性腺雌激素受體 (ERα)基因mRNA相對表達(dá)量在14—30d顯著高于對照組, 雄魚在第6至第21天顯著高于對照組。研究表明, 殼聚糖-HCG緩釋制劑一次埋植后可在21d內(nèi)穩(wěn)定持久地釋放激素, 對調(diào)節(jié)魚類的生殖機能具有良好的促進效果。

緩釋制劑; HCG; 殼聚糖; 性激素; 基因表達(dá)

硬骨魚類繁殖過程是在下丘腦-垂體-性腺軸(HPG軸)的整合調(diào)節(jié)控制下進行的。許多經(jīng)濟魚類在人工養(yǎng)殖條件下腦垂體不能正常分泌和釋放促性腺激素(GtH), 因而性腺發(fā)育遲緩, 達(dá)不到性成熟或性成熟時間很長[1,2]。業(yè)已證明, 與激素投喂或是傳統(tǒng)反復(fù)注射方法相比, 激素緩釋制劑只需一次給予, 即可使血清激素濃度較長時間穩(wěn)定在有效閾值, 顯著提高腦垂體和血清GtH水平, 以及雌魚 E2水平和雄魚 T水平, 既加快性腺發(fā)育, 又能減少操作次數(shù)、減輕對魚體的刺激, 收到較好催產(chǎn)效果[3]。前人研究表明, 傳統(tǒng)的注射HCG誘導(dǎo)日本鰻鱺(Anguilla japonicus)性腺發(fā)育成熟需要連續(xù)處理幾周, 采用緩釋方法僅需2—3次[4], 鄧岳松等利用緩釋激素對雌性日本鰻鱺催熟, GSI 平增加7.9%[5], 后來實驗證明對雄性日本鰻鱺也有促進性腺成熟效果[6]。Barbaro, et al.與Mylonas, et al.則證明緩釋激素對親魚精卵質(zhì)量、數(shù)量, 精子活度等均無不良影響[7,8]。

人絨毛膜促性腺激素(HCG)是由α和β二聚體的糖蛋白組成, 分子量為 36700的糖蛋白激素, 已被廣泛用于硬骨魚類的催產(chǎn)排卵[9]。生殖內(nèi)分泌的研究表明, HCG 的生理作用與腦垂體促黃體激素(LH)等同,且沒有種的特異性[10,11], 因而能與 L H受體特異結(jié)合而促使卵巢排卵, 進而調(diào)節(jié)魚類的生殖過程。

細(xì)胞色素 P450芳香化酶(Aromatase)廣泛存在于大多數(shù)脊椎動物的腦和垂體中, 其中性腺型芳香化酶(CYP19A)是硬骨魚類雄激素睪酮(T)生物合成雌激素(主要是雌二醇, E2)的生理過程中的關(guān)鍵酶和限速酶[12,13], 從而實現(xiàn)硬骨魚性別轉(zhuǎn)化、分化的生理調(diào)控[14]。雌激素受體(ERα)是雌激素作用的通路,啟動雌激素應(yīng)答元件轉(zhuǎn)錄, 從而發(fā)揮雌激素效應(yīng)[15]并且對性腺的發(fā)育起到關(guān)鍵作用[16]。

殼聚糖是幾丁質(zhì)(Chitin)經(jīng)過脫乙酰作用所得到的, 與硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸等物質(zhì)結(jié)構(gòu)類似, 在動物體內(nèi)經(jīng)過代謝, 降解為氨基葡萄糖, 有較好的生物相容性。對實驗動物毒性較低并且可以被吸收利用, 是一種良好的藥物釋放載體[17—19]。前人曾采用膽固醇和纖維素制備激素緩釋劑, 釋放量存在顯著個體差異; 而乙烯和乙烯基乙酸聚合而成的激素緩釋劑則難以降解[1]。比較而言, 殼聚糖在激素緩釋制劑應(yīng)用方面的研究尚未見報道。

金魚(Carassius auratus L. var, 俗稱goldfish),屬鯉形目, 鯉科, 鯉亞科, 鯽屬。具有繁殖能力強、性成熟早、多次產(chǎn)卵等特征, 通常被用作模式物種來研究[20,21]。本論文采用殼聚糖制備人絨毛膜激素緩釋制劑(Chitin-HCG), 以繁殖內(nèi)分泌模式動物金魚(Carassius auratus L. var)為研究對象, 觀察Chitin-HCG緩釋制劑對金魚生殖內(nèi)分泌機能及對生殖相關(guān)基因表達(dá)的影響, 以期從理論上闡述緩釋催產(chǎn)激素對魚類各生理指標(biāo)的調(diào)節(jié)方式,為今后制備經(jīng)濟魚類緩釋激素制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗魚來源

在青島市某金魚養(yǎng)殖場采集同一批受精卵所孵化的一齡鎦金金魚, 共180尾, 其中雌魚90尾, 雄魚 90 尾, 體長為(7.76±0.76) cm, 體質(zhì)量為(50.60±8.94) g, 雌雄金魚均為第一次生殖周期。由中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院生物化學(xué)實驗室提供直徑約為(50—150) μm的殼聚糖微球, 金魚暫養(yǎng)于規(guī)格為40 cm×50 cm×35 cm的玻璃水族箱中, 每箱15尾, 每兩箱為一個實驗組, 每天投喂配合飼料 2次,充氣, 全循環(huán)流水; 暫養(yǎng)與養(yǎng)殖期間光照周期為12∶12, 水溫為(18.21±1.95) ; pH℃ 為 7.84—8.12;硬度為4.46 mmol/L; 溶解氧為(7.62±0.56) mg/L。在實驗開始時, 暫養(yǎng)金魚性腺與自然狀態(tài)下金魚性腺發(fā)育同步, 采用石蠟包埋與 HE染色進行性腺組織結(jié)構(gòu)觀察, 雌性金魚卵母細(xì)胞處在大生長期晚期(III卵巢)見圖 1A, 雄性金魚精巢精小葉腔內(nèi)充滿大量的精子細(xì)胞(IV期精巢)見圖1B。

圖1 金魚卵巢(A)和精巢(B)切片(比例尺=70 μm)Fig. 1 Histological sections in the ovary III (A) and the testis IV (B) of female and male Goldfish (Carassius auratus L. var) (Scale=70 μm)

1.2 實驗方法

實驗分組及取樣 實驗分三組進行: A 組:對照組, 一次性注射0.7%生理鹽水200 μL, 實驗魚類數(shù)量為60尾, 雌雄魚各半; B組: 殼聚糖-HCG緩釋制劑埋植組(簡稱緩釋制劑埋植組), 參照鄧岳松[2]埋植 1%殼聚糖-HCG 緩釋激素 200 μL (含HCG200IU), 實驗魚60尾, 雌雄魚各半; C組: HCG注射組, 一次性注射HCG 200 μL(500IU/L), 實驗魚數(shù)量為60尾, 雌雄各半。

對于對照組和HCG注射組實驗魚, 通過胸鰭基部進行生理鹽水和HCG注射, 殼聚糖-HCG緩釋制劑埋植組, 將預(yù)先制作好的緩釋微球與生理鹽水制成懸濁液后, 用眼科手術(shù)刀將腹膜劃開 2 mm進行腹腔埋植, 傷口用抗生素處理。通過預(yù)實驗, 確定最佳實驗時間為 30d, 并根據(jù)預(yù)實驗采樣結(jié)果確定在埋植第0、第2、第6、第14、第21、第30天, 取樣 5尾金魚。采樣前用 MS-222進行麻醉 10min (1/30000濃度), 尾靜脈取血, 分離血清; 解剖取出精巢、卵巢組織, 部分置于波恩試液中固定, 將性腺、肝臟等組織立即放入經(jīng)RNASE-FREE處理過的EP管中, 在液氮罐中暫時保存, 轉(zhuǎn)移于–80℃超低溫冰箱中長期保存用于RNA提取。計算金魚性成熟系數(shù)(Gonadosomatic index, GSI)=性腺重/魚體全重。

血清激素測定 采用放射性同位素(125I)標(biāo)記的放射免疫測定法(RIA), 將天津九鼎醫(yī)學(xué)生物有限公司生產(chǎn)的試劑盒測定方法進行改進, 即半微量測定: 將標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低濃度(10 ng/dl和10 pg/mL)用0標(biāo)準(zhǔn)液稀釋到1 ng/dl或1 pg/mL, 然后再采用半微量法(125I標(biāo)記物、標(biāo)準(zhǔn)品濃度、第一和第二抗體加半量)測定。采用1min計數(shù)cpm, 所得到的結(jié)果被2除。

基因表達(dá) ①性腺總RNA的提取及RNA中DNA去除: 隨機選取金魚各3尾, 用RNAiso Reagent法抽提總RNA, 通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性, 微量紫外分光光度計測定RNA濃度。以 DNaseI酶去除基因組 DNA。 ②RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA: 根據(jù)TaKaRa公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄體系進行cDNA第一鏈的合成。合成的 c DNA保存于–20℃?zhèn)溆?。反轉(zhuǎn)錄體系如下: RNA 2μg, Oligo-dT18 4 μL, 補充RNase-free水至13 μL, 進行cDNA第一鏈的合成。70℃加熱 10min, 后迅速在冰上冷卻。繼續(xù)加入M-MLV Buffer 5 μL, M-MLV 1 μL, Rnase inhibitor 1 μL, dNTPs 5 μL。經(jīng)過37℃60min, 70℃15min, 95℃加熱 5min, 結(jié)束反應(yīng)。③CYP19A基因和 ERα基因mRNA擴增: 取所需檢測的組織樣品cDNA 1 μL作為模板進行PCR擴增。實驗所需的3對 PCR特異性引物由Primer 5.0軟件設(shè)計(表1), 選擇含量豐富、穩(wěn)定, RT-PCR 背景豐富的18S rRNA作為反應(yīng)的內(nèi)參照物。取5 μL的PCR產(chǎn)物進行電泳。對電泳結(jié)果采用Tanon GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)進行分析。

表1 金魚性腺型芳香化酶基因(CYP19A)、雌激素受體(ERα)和18S基因的表達(dá)所用引物Tab. 1 Primers used for goldfish CYP19A, Erα and 18S gene mRNA expression analysis

數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 用SPSS 13.0軟件對相同采樣時間點的雌、雄魚各組數(shù)據(jù)進行Duncan氏多重比較, 所得結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。

2 結(jié)果

2.1 HCG緩釋制劑對金魚性腺發(fā)育的影響

HCG-殼聚糖微球埋植組和HCG注射組雌性金魚性成熟系數(shù)的變動趨勢均呈現(xiàn)先升高后下降(圖2), 性成熟系數(shù)在緩釋制劑埋植后第14至第30天顯著高于對照組(P＜0.05)。對于雄性金魚性成熟系數(shù), HCG-殼聚糖微球埋植組在埋植后第 6天顯著高于對照組和HCG埋植組(P＜0.05)并達(dá)到最高值; HCG注射組在整個實驗期間呈現(xiàn)先上升再下降的變動趨勢(圖2)。

2.2 HCG緩釋制劑對金魚血清激素水平的影響

HCG緩釋制劑對金魚血清睪酮(T)水平的影響

實驗期間, 雌性金魚血清睪酮水平在HCG緩釋制劑的作用下呈現(xiàn)規(guī)律性變動, 波動范圍為2.18—11.386 ng/dl。HCG緩釋制劑埋植組血清睪酮水平在緩釋制劑埋植后第6至第21天顯著高于對照組(P＜0.05), 在埋植后第21、第30天顯著高于HCG注射組(P＜0.05)且第 21天出現(xiàn)最高值; 埋植后第 6天HCG注射組血清睪酮最高值出現(xiàn)。HCG緩釋制劑埋植組、HCG注射組血清睪酮水平在實驗期間隨時間均呈現(xiàn)出先升后降的變化趨勢(圖3)。雄性金魚血清睪酮水平在 HCG緩釋制劑作用下也呈現(xiàn)規(guī)律性的變動, 變動范圍為 13.11—76.22 ng/d。其中, HCG緩釋制劑埋植組在緩釋制劑埋植后第2、第14天顯著高于對照組(P＜0.05), 在第 2天顯著低于HCG注射組(P＜0.05), 在第14天出現(xiàn)最大值; HCG注射組最高值出現(xiàn)于埋植后第 2天, 最低值出現(xiàn)在第6天。HCG-殼聚糖微球埋植組、HCG注射組均呈現(xiàn)出先升高后下降的變化趨勢(圖3)。

圖2 實驗期間受試魚性成熟系數(shù)變動Fig. 2 The changes of gonad somatic index of male and female goldfish during experiments

HCG緩釋制劑對金魚血清雌二醇(E2)水平的影響 HCG緩釋制劑埋植組、HCG注射組血清雌二醇水平在整個實驗期間隨時間的變化呈現(xiàn)先升后降的趨勢, 水平波動在3.570—24.36 pg/mL。在雌魚中, HCG緩釋制劑埋植組在埋植后第6至第30天顯著高于對照組(P＜0.05), 在埋植后第14至第21天顯著高于 HCG注射組(P＜0.05), 緩釋制劑埋植后第14天出現(xiàn)最高值; HCG注射組血清雌二醇水平最高值出現(xiàn)于注射后第2天(圖4)。雄性金魚血清雌二醇水平在1.74—6.77 pg/mL變動。HCG緩釋制劑埋植組在埋植后第 2天顯著低于 HCG注射組(P＜0.05),緩釋制劑埋植后第14天最高值出現(xiàn); HCG注射組在處理后第2至第14天顯著高于對照組(P＜0.05), 其最高值出現(xiàn)于注射后第2天(圖4)。

圖3 實驗期間受試魚血漿睪酮(T)含量變動Fig. 3 The levels of serum testosterone of male and female goldfish during experiments

圖4 實驗期間受試魚雌二醇(E2)含量變動Fig. 4 The levels of serum estradiol of male and female goldfish during experiments

2.3 HCG緩釋制劑對金魚性腺基因相對表達(dá)量的影響

CYP19A基因在各組織中的表達(dá) 取正常的金魚的卵巢、精巢、腦、肝臟、腸、心、脾、腎、鰓和肌肉10個組織, 用半定量RT-PCR的方法測定CYP19A基因的表達(dá)情況。如圖5所示, 該基因在上述10種組織中都有表達(dá), 但是表達(dá)量有所差異: 性腺中表達(dá)豐富, 心臟中最少。

圖 5 CYP19A基因mRNA在金魚各組織表達(dá)Fig. 5 The expression of CYP19A gene in the tissues of the goldfish

HCG緩釋制劑對金魚性腺CYP19A基因mRNA相對表達(dá)的影響 HCG緩釋制劑埋植組、HCG注射組CYP19A基因mRNA相對表達(dá)量在整個實驗過程中隨時間變化出現(xiàn)了先升高后下降的變化趨勢。雌性金魚HCG緩釋制劑埋植組CYP19A基因mRNA相對表達(dá)量在埋植后第 2至第 6天顯著高于對照組(P＜0.05), 其最高值出現(xiàn)在埋植后第2天; HCG注射組CYP19A基因mRNA相對表達(dá)量在注射后第6天出現(xiàn)最高值(圖 6)。HCG緩釋制劑埋植組在埋植后第6天金魚精巢中CYP19A基因mRNA相對表達(dá)量顯著高于對照組(P＜0.05), 在其余各樣品采集時間點與對照組和HCG注射組均沒有出現(xiàn)顯著性差異, 其最高值出現(xiàn)于緩釋制劑埋植后第6天; HCG注射組在各樣品采集時間點均沒有與對照組出現(xiàn)顯著性差異, 其最高值出現(xiàn)于埋植后第6天(圖6)。

HCG緩釋制劑對金魚性腺ERα基因mRNA相對表達(dá)量的影響 HCG緩釋制劑埋植組、HCG注射組雌性金魚卵巢ERα基因mRNA相對表達(dá)量隨時間變化呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢(圖7)。HCG緩釋制劑埋植組在埋植后第14至第30天顯著高于對照組(P＜0.05), 在埋植后第6天顯著低于HCG注射組(P＜0.05), 在埋植后第 14至第 30天顯著高于HCG注射組(P＜0.05), 其相對表達(dá)量最高值出現(xiàn)于緩釋制劑埋植后第 14天; HCG注射組 ERα基因mRNA相對表達(dá)量的最高值出現(xiàn)于注射后第6天。HCG緩釋制劑埋植組、HCG注射組對雄性金魚精巢ERα基因mRNA相對表達(dá)量在整個實驗過程中隨時間的變化呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢(圖 7)。HCG緩釋制劑埋植組在埋植后第6至第21天顯著高于對照組(P＜0.05), 其最高值出現(xiàn)于埋植后第 14天; HCG注射組ERα基因mRNA相對表達(dá)量在注射后第21天出現(xiàn)最高值。

圖6 實驗期間受試魚CYP19A基因 mRNA相對表達(dá)量Fig. 6 Relative expression level of CYP19A in male and female goldfish during experiments

圖7 實驗期間受試魚ERα基因 mRNA相對表達(dá)量Fig. 7 Relative expression level of ERα mRNA in male and female goldfish during experiments

3 討論

基于納米緩釋微球激素制作標(biāo)準(zhǔn), 考慮到鯉科魚HCG用量標(biāo)準(zhǔn)[22,23], 結(jié)合養(yǎng)殖生產(chǎn)實踐經(jīng)驗, 本實驗確定緩釋載體與催產(chǎn)激素使用量為 10-20:1(含HCG200IU)。結(jié)果表明, Chitin-HCG緩釋納米微球能夠通過正反饋途徑促進金魚性腺發(fā)育, 在埋植30d時間內(nèi), 雌魚GSI顯著升高, 能顯著誘導(dǎo)血清睪酮和雌二醇分泌, 證明Chitin-HCG緩釋納米微球激素的效果長久且穩(wěn)定。

雌性金魚實驗期間性腺CYP19A基因mRNA相對表達(dá)量在第 2、第6天顯著高于對照組, 在 14—30d仍高于對照組卻無顯著性差異, 血清中雌二醇也在第 6天后顯著高于對照組, 由于無法測量金魚血清中GtH濃度, 推測是緩釋激素促進了垂體釋放GtH, 進而GtH作用卵巢膜細(xì)胞合成雌激素前體(睪酮), 再經(jīng)顆粒細(xì)胞層芳香化為雌二醇。雌二醇可以作用于肝臟合成卵黃原蛋白, 而CYP19A是雌激素的生成關(guān)鍵酶和限速酶[13], 催化雄激素(尤其是睪酮)轉(zhuǎn)化為雌二醇[24,25], 血清雌二醇含量和CYP19A基因 mRNA相對表達(dá)量的顯著升高, 說明Chitin-HCG緩釋激素能較好的促進雌性金魚卵巢的發(fā)育, 特別是 III-IV時卵黃的積累。ERα是雌激素(雌二醇)的作用通路, 雌激素通過雌激素受體(ERα)可以刺激催乳素, 生長激素等激素的分泌[26]。ERαmRNA相對表達(dá)量在14—30d顯著高于對照組, 驗證了Chitin-HCG對金魚的生殖生長有促進作用。作為雌二醇的前體物質(zhì), 雌性金魚血清睪酮水平在14—30d時間內(nèi)顯著升高, 說明埋植緩釋HCG制劑能顯著提高血清睪酮濃度。林浩然在其所著的《魚類生理學(xué)》中曾指出GtH促使卵巢膜細(xì)胞產(chǎn)生大量睪酮, 用睪酮做底物和顆粒細(xì)胞層孵育, 可產(chǎn)生大量雌二醇[27]。趙會宏等研究了斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)卵巢發(fā)育過程血清性類固醇激變化, 結(jié)果進入生殖季節(jié)斜帶石斑魚體內(nèi)的雌二醇及睪酮含量增長迅速[28]; 張利紅等對性未成熟的雌性日本鰻鱺(Anguilla japonica)進行 ADSD (睪酮前體物質(zhì))埋植, 顯著促進了埋植雌魚性腺發(fā)育[29]。

雄魚GSI、性腺CYP-19A基因mRNA相對表達(dá)量在第6天均顯著高于對照組, 楊艷平對許氏平鲉(Sebastes schlegeli)精巢進行免疫組織化學(xué)分析, 結(jié)果能分泌雄激素的精巢間質(zhì)細(xì)胞對芳香化酶抗體有較強免疫陽性[30]。本實驗在一定程度上驗證了CYP19A對雄魚的精巢發(fā)育有積極的生理作用, 但是雄魚血清睪酮被腦型芳香化酶(CYP19B)芳香化為雌二醇, 因此CYP19A如何作用于雌二醇進而調(diào)節(jié)精巢發(fā)育有待于進一步研究。雄性金魚ERα基因mRNA相對表達(dá)量在6—21d顯著高于對照組, 與溫海深等的研究相似, 即E2與其受體結(jié)合后對精巢發(fā)育起到關(guān)鍵作用的結(jié)果相符[16], 進而促進雄魚性腺發(fā)育。

另外, CYP19A基因mRNA在性腺、肝、脾中表達(dá)豐富, 猜測 CYP19A有較為廣泛的生理功能, 其在肝脾, 甚至肌肉中的作用機理值得我們進一步探究。值得注意的是, CYP19A在腦中也有表達(dá), 但表達(dá)量低于性腺, 徐跑等[31]研究黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)也曾發(fā)現(xiàn) CYP19B(腦型芳香化酶)表達(dá)量為丘腦＞垂體＞端腦＞性腺。兩種芳香化酶互相的作用機制也為進一步的探究提供了思路。

非緩釋的HCG注射組, 對金魚生殖內(nèi)分泌也起到了一定的調(diào)控效果, 但是持續(xù)時間較短, 如圖 3中注射第2、第6天后的雄魚血清睪酮水平, 藥物濃度急速達(dá)到峰值, 然后驟降, 相關(guān)數(shù)據(jù)表現(xiàn)出極大地波動性, 血清激素水平的劇烈波動不僅不能夠起到較好的促進性腺發(fā)育的效果, 反而會對魚體產(chǎn)生脅迫作用。因此, 與傳統(tǒng)的注射方式比較, Chitin-HCG緩釋激素可以長久、穩(wěn)定地對金魚性腺發(fā)育產(chǎn)生促進作用。殼聚糖微球作為經(jīng)濟魚類緩釋激素載體使用, 有較好的生物相容性, 不會對埋植魚體產(chǎn)生脅迫反應(yīng), 還可以使激素在魚體的釋放形成有效的濃度梯度, 促進藥物吸收, 起到保持藥物活性, 提高藥物穩(wěn)定性的作用, 從而促進經(jīng)濟魚類性腺發(fā)育。

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STUDIES ON THE EFFECTS OF SUSTAINED-RELEASE DELIVERY SYSTEMS OF CHITIN-HUMAN CHORIONIC GONADOTROPIN (CHITIN-HCG) ON REPRODUCTION ENDOCRINE FUNCTION OF GOLDFISH (CARASSIUS AURATUS L. VAR)

HOU Zhi-Shuai, WEN Hai-Shen and YIN Xiang-Han
(Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

With Sustained-release delivery systems of Chitin-Human Chorionic Gonadotropin (Chitin-HCG), at regular intervals after implantation of Chitin-HCG, we detected the gonadal developments, the levels of major sex hormones in serum and the relative expression levels of genes for reproduction endocrine function of female and male fish. The results showed that implanted the Chitin-HCG, the gonado-somatic index (GSI), levels of testosterone (T) and estradiol (E2) of female fish were more effective than the controlled group from the 6thday to the 30thday. The GSI of male fish was significantly higher than the controlled group only at the 6thday after implantation. The levels of testosterone (T) of male fish were significantly higher than the controlled group at the 2ndand the 14thday after implantation and the levels of estradiol (E2) of male fish showed no significant difference with the controlled group. With the RT-PCR, it showed that the content of the relative expression level of CYP19A mRNA was the most significant in gonad and the least significant in heart. The result of RT-PCR showed that the relative expression level of CYP19A mRNA in gonad of female fish was significantly higher than the controlled group at the 2ndand the 6thday after implantation, and that of the male fish was significantly higher than the controlled group at the 6thday after implantation. The relative expression level of ERα mRNA in gonad of female fish was significantly higher than the controlled group from the 14thday to 30thday after implantation, and that of the male fish was significantly higher than the controlled group from the 6thday to the 21stday after implantation. In conclusion, after implantation of Chitin-HCG, the HCG can be released steadily and regularly in 21 days, promoting and regulating the reproduction endocrine function of fish.

Sustained-release delivery systems; HCG; Chitin; Sex hormone; Gene expression

S961.2; Q579.1

A

1000-3207(2014)01-0129-08

10.7541/2014.17

2012-12-17;

2013-10-17

國家自然科學(xué)基金項目(41176122); 中國海洋大學(xué)國家大學(xué)生創(chuàng)新實驗項目(1111010603)資助

侯志帥(1990—), 男, 山東青島人; 碩士; 研究方向為魚類內(nèi)分泌與生殖調(diào)控。E-mail: zhishuaihaida@163.com

溫海深(1963—), 男, 博士, 教授; E-mail: wenhaishen@ouc.edu.cn