周堅喬，羊 悅，楊勝利*

（浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014）

冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）為我國特有的名貴藥用真菌。蟲草中含有多種生理活性物質(zhì)，中醫(yī)藥文獻認為冬蟲夏草味甘性溫，有泌精益氣、保肺補腎、止血化痰的功效[1-3]。近代醫(yī)學(xué)臨床研究表明，冬蟲夏草能治療勞咳痰血、盜汗、陽痿、遺精、黃膽病、肺結(jié)核及老年衰弱、慢性咳喘等癥，有強壯兼收斂鎮(zhèn)靜的效果[4-7]。冬蟲夏草所含蟲草素能明顯增強紅細胞黏附腫瘤細胞的能力，抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，能明顯提升白血球和血小板數(shù)量，迅速改善放化療后的嘔吐惡心、胃口差、頭發(fā)脫落、失眠等癥狀[8-12]。但天然的冬蟲夏草產(chǎn)量十分稀少，因此，采用培養(yǎng)冬蟲夏草菌絲體來替代天然冬蟲夏草。目前，人工蟲草菌絲體的生產(chǎn)多以液體深層發(fā)酵為主。隨著研究的深入，蟲草也被廣泛應(yīng)用于保健食品的開發(fā)，如蟲草酒、蟲草飲料和蟲草藥膳。目前蟲草素的研究現(xiàn)正成為食品保健和藥物化學(xué)中一個極其活躍的領(lǐng)域。蟲草菌深層發(fā)酵的產(chǎn)物直接作為食品雖然還未能為人們接受，但被加工成口服液、營養(yǎng)液、食品添加劑、軟飲料、含酒精飲料等，已逐漸被人們所接受。蟲草液體發(fā)酵產(chǎn)物的另一個主要用途是其代謝提取物。即從深層發(fā)酵產(chǎn)物中提取多種有效成分，如多糖、多肽、生物堿、萜類化合物、甾醇、苷類、酚類、酶、核酸、氨基酸、維生素等。

硒是人和動物體內(nèi)必需的一種元素，缺硒可以導(dǎo)致多種癥狀[13-15]。如人體缺硒會誘發(fā)心血管疾病、癌癥、克山病及大骨節(jié)病等[16-17]，而動物缺硒主要表現(xiàn)為白肌病和生長緩慢等[18-20]。如牛缺硒時，會出現(xiàn)骨骼肌和心肌變性，生長緩慢，消瘦，犢牛腹瀉；豬缺硒時，表現(xiàn)為肝營養(yǎng)不良，仔豬出現(xiàn)白肌病、?？靶摹⑽笣兊?。硒在菌絲體內(nèi)主要以硒蛋白和硒多糖的形式存在。其中，硒半胱氨酸是構(gòu)成某些酶活性中心的重要組分，其作用是充當氧化還原中心。硒多糖具有重要的藥理活性如免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等。

啤酒糟是啤酒加工副產(chǎn)物，通過微生物將其轉(zhuǎn)化為營養(yǎng)豐富、適口性好、附加值高、經(jīng)濟效益顯著的食品添加劑或者微生物飼料是最經(jīng)濟有效的方法之一。廢渣中含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)，經(jīng)微生物發(fā)酵后，可轉(zhuǎn)變成更加有效的生物活性物質(zhì)，作為動物飼料不僅能夠提高飼料的營養(yǎng)價值，更能提高畜禽的抗病能力和生產(chǎn)能力。如果將這些活性成分進一步分離純化，可以作為食品添加劑甚至是藥品。

本研究采用冬蟲夏草作為富硒的載體，啤酒糟作為基質(zhì)，進行富硒冬蟲夏草液態(tài)深層發(fā)酵工藝優(yōu)化。研究冬蟲夏草對無機硒的生物轉(zhuǎn)化能力，為富硒冬蟲夏草的進一步研究應(yīng)用打下基礎(chǔ)。以蟲草為出發(fā)菌株，啤酒糟為基質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)相應(yīng)的產(chǎn)品，不僅能夠提高農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物附加值，更能創(chuàng)造良好的社會效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

冬蟲夏草：梁山正大食用菌研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯提取液20%，葡萄糖2%，磷酸二氫鉀0.3%，硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.15%，瓊脂2%。

種子培養(yǎng)基：馬鈴薯提取液20%，葡萄糖2%，蛋白胨l%，酵母提取物1%，磷酸二氫鉀0.3%，硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.15%。

發(fā)酵培養(yǎng)基：啤酒糟1%～3%，亞硒酸鈉（Na2SeO3）10～30 mg/L。

1.1.3 試劑

葡萄糖（分析純）：上海青析化工科技有限公司；瓊脂粉（生化試劑）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨（生化試劑）：南通東海龍生物制品有限公司；酵母膏（生化試劑）：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；磷酸二氫鉀（分析純）：湖州湖試劑化學(xué)試劑有限公司；硫酸鎂（分析純）：上海申博化工有限公司；亞硒酸鈉（分析純）：上海鶴善生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PerkinElmer AAanalvst 800原子吸收分光光度計：美國珀金埃爾默公司；HZQ-2數(shù)顯全溫振蕩器、SPX-150智能生化培養(yǎng)箱：常州邁科諾儀器有限公司；CP323S電子天平：德國賽多利斯天平公司；PHS-3C精密pH計：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

250 mL搖瓶裝液量50 mL，接種斜面菌塊，置于搖床中，轉(zhuǎn)速160 r/min，20 ℃培養(yǎng)4 d。

1.3.2 亞硒酸鈉添加量的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基中亞硒酸鈉的質(zhì)量濃度分別為10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L、25 mg/L、30 mg/L，接種量10%，轉(zhuǎn)速200 r/min，20 ℃培養(yǎng)10 d，測定富硒蟲草菌絲體中硒的含量。

1.3.3 啤酒糟添加量的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基中啤酒糟的質(zhì)量濃度分別為10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L，接種量10%，轉(zhuǎn)速160 r/min，20 ℃培養(yǎng)10 d，測定富硒蟲草菌絲體中硒的含量。

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

在單因素試驗基礎(chǔ)上，考察pH值、接種量、轉(zhuǎn)速對菌絲體生長和富硒量的影響，選定這3個因素，進行正交試驗L9（33），其因素和水平見表1。

表1 冬蟲夏草發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for fermentation conditions optimization of Cordyceps sinensis

1.3.5 分析方法

（1）生物量測定

采用干重法。發(fā)酵液經(jīng)4 000 r/min離心15 min去除上清液，菌絲體用去離子水洗滌3次后離心，置于烘箱內(nèi)60 ℃烘干至質(zhì)量恒定后稱質(zhì)量。

（2）硒含量測定

采用原子吸收分光光度法測定菌絲體中硒的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 富硒蟲草菌絲體的生長

將培養(yǎng)好的種子液按10%的接種量。接入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在160 r/min、20 ℃條件下培養(yǎng)。每隔1 d取樣測定菌絲體干質(zhì)量，以生物量（菌絲體干質(zhì)量）為縱坐標，發(fā)酵時間（d）為橫坐標繪制菌體生長曲線，結(jié)果如圖1所示。

圖1 富硒冬蟲夏草生長曲線Fig.1 Growth curve of selenium-rich Cordyceps sinensis

由圖1可知，培養(yǎng)10 d 內(nèi)，富硒冬蟲夏草菌絲體的生物量隨著時間的增加逐漸增長，在第10天達到最大值，第10天之后菌體出現(xiàn)自溶，因此，后續(xù)試驗選擇培養(yǎng)時間為10 d。

2.2 啤酒糟添加量對冬蟲夏草菌絲體富硒量的影響

以冬蟲夏草為出發(fā)菌株，優(yōu)化啤酒糟的質(zhì)量濃度，分別選擇10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L 和30 g/L，添加25 mg/L Na2SeO3，pH值為6，接種量為10%，在溫度為20 ℃，搖瓶轉(zhuǎn)速為160 r/min條件下培養(yǎng)10 d，考察啤酒糟的添加量對蟲草菌絲體富硒量的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 啤酒糟添加量對蟲草生物量和富硒量的影響Fig.2 Effect of beer distiller’s grains’addition on biomass and selenium accumulation amount

由圖2可知，隨著啤酒糟質(zhì)量濃度的增加，生物量和富硒量都在增加，啤酒糟質(zhì)量濃度在20 g/L 達到最大值。從實驗過程來看，隨著啤酒糟質(zhì)量濃度的增加，培養(yǎng)基也逐漸變黏稠，啤酒糟質(zhì)量濃度＞30 g/L，培養(yǎng)基的流動性受到影響，因此，影響到養(yǎng)分的傳遞和吸收，也會影響代謝產(chǎn)物的釋放。同時蟲草菌是好氧菌，也對溶氧受到影響，將直接影響生物量和富硒量。因此選擇啤酒糟質(zhì)量濃度為20 g/L。

2.3 亞硒酸鈉添加量對冬蟲夏草菌絲體富硒量的影響

以冬蟲夏草為出發(fā)菌株，啤酒糟質(zhì)量濃度為20 g/L，pH值為6，接種量為10%，在溫度為20 ℃，搖瓶轉(zhuǎn)速為160 r/min條件下，培養(yǎng)10 d，考察發(fā)酵培養(yǎng)基中亞硒酸鈉的質(zhì)量濃度分別為10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L、25 mg/L、30 mg/L對蟲草菌絲體富硒量的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 亞硒酸鈉添加量對冬蟲夏草菌絲體富硒量的影響Fig.3 Effect of sodium selenite addition on selenium accumulation in Cordyceps sinensis

由圖3可知，隨著亞硒酸鈉質(zhì)量濃度的升高，富硒量也在增加，但增加到一定程度又開始下降，可能是因為高濃度的亞硒酸鈉有劇毒。當培養(yǎng)基中亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為10～25 mg/L時，蟲草可以生長并在菌絲體內(nèi)富集硒，說明蟲草對低濃度的亞硒酸鈉具有耐受性，并且最適亞硒酸鈉添加量為25 mg/L。

2.4 發(fā)酵條件對蟲草菌絲體富硒量的影響

為考察不同發(fā)酵條件對菌絲體生長和富硒量的影響，試驗選pH值、接種量、轉(zhuǎn)速3因素，在裝液量為50 mL/250 mL，發(fā)酵溫度20 ℃，加亞硒酸鈉質(zhì)量濃度25 mg/L，啤酒糟質(zhì)量濃度20 g/L，培養(yǎng)時間10 d的條件下，進行L9（33）正交試驗，在參考已知文獻及前期試驗的基礎(chǔ)上，以總富硒量（菌絲干質(zhì)量×硒含量）為評價指標，優(yōu)化液態(tài)深層發(fā)酵工藝。正交試驗結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 冬蟲夏草液態(tài)深層發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment for submerged fermentation conditions optimization of Cordyceps sinensis

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment results

由表2可知，各因素對蟲草菌絲體的生長和富硒量的影響作用大小為轉(zhuǎn)速＞接種量＞pH值。確定冬蟲夏草菌絲體的富硒量的最佳工藝條件為A2B3C3，即pH值為7，接種量15%，轉(zhuǎn)速為180 r/min。在此優(yōu)化條件下進行驗證試驗，總富硒量為5 808.20 μg/L。

由表3可知，各因素對蟲草菌絲體富硒量影響大小順序為C（轉(zhuǎn)速）＞B（接種量）＞A（pH值），搖床轉(zhuǎn)速對結(jié)果的影響有顯著影響，而接種量和pH值對結(jié)果無顯著影響。

3 結(jié)論

富硒微生物是一種高效、安全、營養(yǎng)均衡的補硒制劑。富硒冬蟲夏草更是具有有機硒的功能，同時具有冬蟲夏草的保健活性，目前多以牛肉膏蛋白胨等價格較貴的材料作為基質(zhì)，而以廉價的啤酒糟作為基質(zhì)生產(chǎn)很少。其工藝的優(yōu)化是一個非常復(fù)雜的動態(tài)過程，影響其結(jié)果的因素也很多，本研究通過單因素試驗和正交試驗，得到優(yōu)化發(fā)酵條件為搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，培養(yǎng)10 d，裝液量為50 mL/250 mL，pH值為7.0，接種量15%，溫度20 ℃，亞硒酸鈉質(zhì)量濃度25 mg/L，啤酒糟質(zhì)量濃度20 g/L。在此條件下，蟲草總富硒量為5 808.20 μg/L。本試驗確定冬蟲夏草富硒的最佳發(fā)酵條件，為以后的研究提供了一定的基礎(chǔ)，今后可進一步選育出優(yōu)良的冬蟲夏草菌株應(yīng)用到發(fā)酵生產(chǎn)中。

[1]LIN Y W,CHIANG B H.Anti-tumor activity of the fermentation broth ofCordyceps militariscultured in the medium ofRadix astragali[J].Process Biochem,2008,43(3):244-250.

[2]ZHANG J L,YU Y C,ZHANG Z F,et al.Effect of polysaccharide from culturedCordyceps sinensison immune function and anti-oxidation activity of mice exposed to 60Co[J].Int Immunopharmacol,2011,11(12):2251-2257.

[3]DONG C H,XIE X Q,WANG X L,et al.Application of Box-Behnken design in optimization for polysaccharides extraction from cultured mycelium ofCordyceps sinensis[J].Food Bioprod Process,2009,87(2):139-144.

[4]XIAO J H,XIAO D M,XIONG Q,et al.Nutritional requirements for the hyperproduction of bioactive exopolysaccharides by submerged fermentation of the edible medicinal fungusCordyceps taii[J].Biochem Eng J,2010,49(2):241-249.

[5]LI S P,ZHAO K,JI Z N,et al.A polysaccharide isolated fromCordyceps sinensis,a traditional Chinese medicine,protects PC12 cells against hydrogen peroxide-induced injury[J].Life Sci,2003,73(19):2503-2513.

[6]CHEN J P,ZHANG W Y,LU T T,et al.Morphological and genetic characterization of a cultivatedCordyceps sinensisfungus and its polysaccharide component possessing antioxidant property in H22 tumor-bearingmice[J].Life Sci,2006,78(23):2742-2748.

[7]ZHANG W Y,LI J,QIU S Q,et al.Effects of the exopolysaccharide fraction(EPSF)from a cultivatedCordyceps sinensison immunocytes of H22 tumor bearing mice[J].Fitoterapia,2008,79(3):168-173.

[8]LEUNG P H,ZHAO S N,HO K P,et al.Chemical properties and antioxidant activity of exopolysaccharides from mycelial culture ofCordyceps sinensisfungus Cs-HK1[J].Food Chem,2009,114(4):1251-1256.

[9]YAN J K,LI L,WANG Z M,et al.Structural elucidation of an exopolysaccharide from mycelial fermentation of aTolypocladiumsp.fungus isolated from wildCordyceps sinensis[J].Carbohyd Polym,2010,79(1):125-130.

[10]LIN R S,LIU H H,WU S Q,et al.Production andin vitroantioxidant activity of exopolysaccharide by a mutant,Cordyceps militarisSU5-08[J].Int J Biol Macromol,2012,51(1-2):153-157.

[11]OHTA Y,LEE J B,HAYASHI K,et al.In vivoantiinfluenza virus activity of an immunomodulatory acidic polysaccharide isolated fromCordyceps militarisgrown on germinated soybeans[J].J Agr Food Chem,2007,55(25):10194-10199.

[12]CHEN W X,ZHANG W Y,SHEN W B,et al.Effects of the acid polysaccharide fraction isolated from a cultivatedCordyceps sinensison macrophagesin vitro[J].Cell Immunol,2010,262(1):69-74.

[13]WANG L,WANG G Y,ZHANG J J,et al.Extraction optimization and antioxidant activity of intracellular selenium polysaccharide byCordyceps sinensisSU-02[J].Carbohyd Polym,2011,86(4):1745-1750.

[14]LU Z Q,JIN M L,HUANG M,et al.Bioactivity of selenium-enriched exopolysaccharides produced byEnterobacter cloacaeZ0206 in broilers[J].Carbohyd Polym,2013,96(1):131-136.

[15]LIU L,PAN D D,ZENG X Q,et al.Effect of selenium-enriched exopolysaccharide produced byLactococcus lactissubsp lactis on signaling molecules in mouse spleen lymphocytes[J].Food Funct,2013,4(10):1489-1495.

[16]RAYMAN M P.The importance of selenium to human health[J].L ancet,2000,356(9225):233-241.

[17]O’DELL B L,SUNDE R A.Handbook of nutritionally essential mineral elements[M].New York:Marcel Dekker Inc,1997.

[18]GUO Y X,PAN D D,LI H,et al.Antioxidant and immunomodulatory activity of selenium exopolysaccharide produced byLactococcus lactissubsp lactis[J].Food Chem,2013,138(1):84-89.

[19]HE N W,SHI X L,ZHAO Y,et al.Inhibitory effects and molecular mechanisms of selenium-containing tea polysaccharides on human breast cancer MCF-7 cells[J].J Agr Food Chem,2013,61(3):579-588.

[20]SUN Y G,XIE X J,HE J P,et al.Enhancement of immune response for newcastle disease vaccine using a combined adjuvant solution of astragalus polysaccharides,levamisole,and selenoprotein[J].Turk J Vet Anim Sci,2013,37(5):516-522.