周賢斌 丁維軍 于長(zhǎng)輝 雷皓 汪洋

放射性腦損傷模型大鼠腦內(nèi)移植超順磁性氧化鐵標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞MRI示蹤研究

周賢斌 丁維軍 于長(zhǎng)輝 雷皓 汪洋

目的 探討超順磁性氧化鐵顆粒標(biāo)記的神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）在放射性腦損傷大鼠模型腦內(nèi)移植后，磁共振成像（MRI）示蹤觀察的可行性。方法 建立放射性腦損傷模型大鼠16只，4周后將磁化標(biāo)記的NSC立體定向植入模型大鼠海馬區(qū)。移植后1、2、4、8周行4．7T MRI干細(xì)胞示蹤觀察，選擇T1WI、T2WI和梯度回波（GRE）序列。移植后1、8周處死大鼠，取腦組織冰凍切片后進(jìn)行普魯士藍(lán)染色。結(jié)果 移植后MRI顯示大鼠注射點(diǎn)處可見(jiàn)類圓形低信號(hào)影；GRE序列顯示標(biāo)記細(xì)胞較清晰，而T2WI顯示大鼠腦正常結(jié)構(gòu)較清晰。移植后1、8周移植部位普魯士藍(lán)染色可見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞，與MRI結(jié)果相符。結(jié)論 MRI能夠在放射性腦損傷大鼠腦內(nèi)活體連續(xù)示蹤觀察NSC的遷移及分布情況。

超順磁性氧化鐵 磁共振成像 干細(xì)胞 放射性腦損傷 大鼠

近年來(lái)，應(yīng)用神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）移植治療腦疾病的研究不斷深入，但對(duì)于移植后神經(jīng)再生的鑒定仍然以免疫組織化學(xué)方法為主，而在臨床及科研工作中，需要一種無(wú)創(chuàng)的方法來(lái)觀察NSC移植后存活、遷移及功能性分化的情況。本實(shí)驗(yàn)以超順磁性氧化鐵（SPIO）納米粒子作為磁性分子探針，體外標(biāo)記NSC，在放射性腦損傷大鼠腦模型腦內(nèi)移植后，利用高場(chǎng)強(qiáng)磁共振成像（MRI）對(duì)標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行示蹤研究[1]。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物NSC的分離培養(yǎng) 孕14～16d的SPF級(jí)SD大鼠購(gòu)自浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，以1.0%戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔麻醉處死后，75.0%乙醇消毒腹部皮膚，取出胚胎，解剖顯微鏡下取中腦腹側(cè)約110mm×115mm×110mm組織塊，將組織塊反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液，200目濾網(wǎng)過(guò)濾，1 500r/min離心10min，棄上清液，加入含1.0%細(xì)胞培養(yǎng)添加劑N2、2.0%無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)添加劑B27和20ng/ml人堿性成纖維生長(zhǎng)因子（hbFGF）的DMEM/F12培養(yǎng)液（美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品），調(diào)整細(xì)胞數(shù)后以5×106/ml接種于新的培養(yǎng)瓶，于37℃、5.0%CO2懸浮培養(yǎng)，每2～3d半量換液1次，每5～7d機(jī)械消化分離克隆傳代1次。NSC的鑒定采用Nestin（美國(guó)BD Pharmingen公司產(chǎn)品）間接免疫熒光化學(xué)染色法[2]。

1.2 NSC的SPIO磁化標(biāo)記 將SPIO（美國(guó)Advanced maganetic公司產(chǎn)品）和轉(zhuǎn)染介質(zhì)TA共孵育1h，制成SPIO-TA復(fù)合物。在NSC培養(yǎng)液中加入50μg/ml的Feridex（美國(guó)Advanced maganetic公司產(chǎn)品，內(nèi)含F(xiàn)e 11.2mg/ml），調(diào)節(jié)終濃度至25μg/ml，將陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine（美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品）以1∶625體積比加入，并混合30min。將NSC上清液離心棄去，以SPIO-TA復(fù)合物重懸，在37℃、5.0%CO2條件下培養(yǎng)1～2h，收集NSC，500r/min離心3min，棄上清液后加入新鮮的NSC培養(yǎng)液。

1.3 SPIO標(biāo)記NSC的普魯士藍(lán)染色[3]以多聚賴氨酸（50μg/ml）預(yù)先處理24孔培養(yǎng)板，將SPIO標(biāo)記的NSC克隆球種植，7d后棄去培養(yǎng)液，以PBS洗滌2次，4.0%多聚甲醛固定30min，蒸餾水反復(fù)洗滌3次；Perl反應(yīng)液作用30min，蒸餾水洗滌3次，1.0%核固紅復(fù)染，再以蒸餾水反復(fù)沖洗，顯微鏡下拍照。

1.4 放射性腦損傷大鼠模型建立[4]及大鼠NSC移植 SPF級(jí)健康雌性SD大鼠16只，體重180～220g，平均（200±20）g，由浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK浙2008-0033）。大鼠經(jīng)3.6%水合氯醛（1ml/100g）腹腔注射麻醉后，俯臥于西門子加速器床板（西門子KD2型），應(yīng)用加速器產(chǎn)生的6MV-X線（劑量率200～210cGy/min），源皮距SSD 100cm，單次全腦照射，照射野3cm×2cm，光野上界位于雙眼后眥連線，下界位于雙耳后連線，左右露空，以1cm厚的組織補(bǔ)償物覆蓋照射野。鉛塊屏蔽雙眼、頸部、胸腹部，參考深度為1.5cm，照射總劑量20Gy。

磁化標(biāo)記的NSC移植至放射性腦損傷大鼠右側(cè)海馬。NSC移植前用PBS重懸，細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107/μl。腦損傷大鼠經(jīng)1.0%戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔注射麻醉后固定于立體定向儀，移植靶點(diǎn)為AP：0.6mm，L：3.0mm，V：4.0mm。各靶點(diǎn)用微量注射器勻速緩慢注入3μl，5min內(nèi)完成，留針5min后緩慢拔針，然后縫合頭皮切口，回籠飼養(yǎng)。

1.5 MRI動(dòng)態(tài)觀察移植后大鼠體內(nèi)SPIO標(biāo)記NSC NSC移植后1、2、4、8周進(jìn)行MRI動(dòng)態(tài)觀察。MRI檢測(cè)在配備有直徑為20cm梯度線圈的4.7 T BIOSPEC 47/30cm動(dòng)物成像儀上完成（德國(guó)Bruker公司產(chǎn)品）。成像實(shí)驗(yàn)用直徑為12cm的Helm-holtz體線圈激發(fā)，直徑為2.5cm的表面線圈接收。成像條件：采用頭顱線圈，窗寬（FOV）=3.5cm×3.5cm，層厚0.8mm，層間距1.6mm。分別進(jìn)行T1自旋回波（SE），T2快速自旋回波（FSE），T2梯度回波（GRE）序列掃描。

1.6 移植后大鼠海馬區(qū)腦組織鐵染色 NSC移植后1、8周進(jìn)行大鼠動(dòng)脈灌注固定取大腦標(biāo)本。具體步驟如下：大鼠行1.0%戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔深度麻醉，開(kāi)胸穿刺入升主動(dòng)脈，0.9%氯化鈉注射液250ml灌注，再用4.0%多聚甲醛灌注，固定約30min。切取自視交叉至其后3mm的腦組織，再以4.0%多聚甲醛固定4h。固定后PBS清洗30min，10.0%蔗糖浸泡2h，20.0%蔗糖浸泡4h，30.0%蔗糖4℃下浸泡過(guò)夜。將腦組織塊置于冰凍包埋液，-20℃冰箱內(nèi)冰凍，切片后行鐵染色。先以免疫組織化學(xué)ABC法染色了解移植細(xì)胞在大鼠腦內(nèi)的分化和存活情況；后行普魯士藍(lán)染色30min，倒置相差顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 大鼠NSC培養(yǎng)與鑒定 孕14～16d的胚胎SD大鼠中腦腹側(cè)細(xì)胞經(jīng)懸浮培養(yǎng)3～5d后，于倒置相差顯微鏡下觀察，部分細(xì)胞形成克隆球，見(jiàn)圖1A?？筃estin免疫熒光染色后于熒光顯微鏡下觀察，間接免疫熒光化學(xué)染色陽(yáng)性，見(jiàn)圖1B。

圖1 大鼠NSC培養(yǎng)與鑒定（A：NSC克隆球，×40；B：熒光顯微鏡下觀察呈Nestin陽(yáng)性，抗Nestin免疫熒光染色，×100）

2.2 SPIO標(biāo)記的NSC腦內(nèi)移植后的MRI觀察[5]由于其特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)，SPIO具有超順磁性。SPIO分布于細(xì)胞后，使組織信號(hào)降低，在T2像上產(chǎn)生低信號(hào)改變。磁化NSC大鼠腦內(nèi)移植后1周，行T1（SE）、T2（FSE）、T2（GRE）掃描在移植區(qū)內(nèi)可見(jiàn)低信號(hào)區(qū)，見(jiàn)圖2。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，到移植后8周T2（GRE）掃描提示移植區(qū)低信號(hào)區(qū)域逐漸有變大的趨勢(shì)，移植區(qū)信號(hào)變?yōu)榛祀s。2.3 移植后大鼠腦組織切片普魯士藍(lán)染色 鏡下可見(jiàn)，普魯士藍(lán)染色陽(yáng)性的細(xì)胞團(tuán)所在部位與MRI成像中的低信號(hào)區(qū)相一致，見(jiàn)圖3。

圖2 移植后大鼠海馬區(qū)T2（GRE）掃描

圖3 移植后大鼠腦組織切片中NSC鐵染色（普魯士藍(lán)染色，×100）

3 討論

近年來(lái)，在動(dòng)物模型中應(yīng)用NSC移植治療腦創(chuàng)傷、缺血性腦損傷及神經(jīng)退行性疾病的研究取得了顯著成就?；铙w評(píng)價(jià)移植后NSC在腦損傷模型宿主腦內(nèi)的遷移和分布已獲得了突破性的進(jìn)展，為NSC移植的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，而在放射性腦損傷方面的應(yīng)用則尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

如何對(duì)移植入體內(nèi)的NSC的存活、遷移、分化進(jìn)行觀察，一直是NSC領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)問(wèn)題，目前的一個(gè)研究熱點(diǎn)是利用非侵入性納米分子影像學(xué)技術(shù)監(jiān)測(cè)、追蹤細(xì)胞在體內(nèi)的活動(dòng)狀況[6]。有研究報(bào)道利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染SPIO標(biāo)記、同時(shí)攜帶綠色熒光蛋白（GFP）的胚胎干細(xì)胞[7]，SPIO能夠增強(qiáng)質(zhì)子弛豫，即使在較弱的磁場(chǎng)中也可產(chǎn)生較大的磁性，而外磁場(chǎng)撤除后磁性也迅速消失。SPIO分布于組織后，造成局部磁場(chǎng)的不均勻，從而加速了質(zhì)子去位相的T2弛豫。本研究證實(shí)，用SPIO標(biāo)記NSC后移植，通過(guò)MRI技術(shù)可以在活體上追蹤這些標(biāo)記細(xì)胞的存活、遷移情況，可在移植后對(duì)NSC進(jìn)行準(zhǔn)確的組織學(xué)分布示蹤。同時(shí)有研究表明SPIO對(duì)NSC的生長(zhǎng)和增殖沒(méi)有明顯影響，轉(zhuǎn)染了SPIO的NSC可以正常地分化為神經(jīng)細(xì)胞[8]。SPIO標(biāo)記非常有利于臨床上NSC移植后的在體細(xì)胞示蹤，通過(guò)MRI能對(duì)其在宿主體內(nèi)的遷移、分布和生存情況進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

SPIO標(biāo)記的NSC植入放射性腦損傷大鼠腦內(nèi)后，本研究發(fā)現(xiàn)在T1（SE）、T2（FSE）、T2（GRE）掃描序列中，T2（GRE）序列上出現(xiàn)較明顯的低信號(hào)區(qū)，這表明GRE是顯示SPIO標(biāo)記的一種敏感掃描序列。移植后8周，T2（FSE）、T2（GRE）掃描仍可觀察到移植區(qū)明顯的低信號(hào)，但低信號(hào)逐漸減弱，同時(shí)在T2（GRE）成像上移植區(qū)低信號(hào)區(qū)域逐漸有變大的趨勢(shì)，伴隨出現(xiàn)高信號(hào)，移植區(qū)信號(hào)變?yōu)榛祀s。筆者認(rèn)為，在MRI上信號(hào)逐漸減弱甚至出現(xiàn)高信號(hào)，是由于移植區(qū)內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)鐵含量下降導(dǎo)致。總之，通過(guò)MRI觀察SPIO標(biāo)記的細(xì)胞能夠?yàn)橐浦布?xì)胞的在體檢測(cè)提供了可靠的方法。

本研究表明，SPIO顆?？梢栽隗w外標(biāo)記胎鼠的NSC，利用MRI能夠連續(xù)示蹤觀察其在放射性腦損傷大鼠腦組織內(nèi)的分布和遷移情況，大鼠腦組織的體外研究證實(shí)了MRI的結(jié)果。

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Magnetic resonance tracking of transplanted neural stem cells labeled with superparamagnetic iron oxide nanoparticles in rats with wholebrain irradiation

Objective To explore the feasibility of labeling neural stem cells(NSCs)with superparamagnetic iron oxide (SPIO)particles in tracking the labeled cells after transplantation into rats with whole brain irradiation．Methods Irradiation injury was induced in 16 female Sprague-Dawley rats by whole brain irradiation．Four weeks after irradiation neural stem cells derived from the brain of 14-d embryonic rats and co-labeled with SPIO and poly-L-lysine were transplanted in the brain of irradiated rats．4．7T MRI scanning was performed to monitor the transplanted cells after 1,2,4,8 weeks．Two rats were sacrificed at week 1 and 8 after transplantation and Prussian blue staining on the brain sections performed．Results The areas with transplanted labeled neural stem cells were presented as hypointense zone on MR images．Prussian blue staining showed labeled cells in the transplanted hippocampus area．Conclusion MRI as a noninvasive procedure is useful for tracking the location and distribution of labeled neural stem cells in rats with whole-brain irradiation．

Superparamagnetic iron oxide Magnetic resonance imaging Stem cellRadiation brain lesions Rat

2014-09-17）

（本文編輯：胥昀）

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（Y2110739）

317000 臺(tái)州，溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺(tái)州醫(yī)院消化內(nèi)科（周賢斌），放療科（丁維軍、于長(zhǎng)輝）；中國(guó)科學(xué)院波譜與原子分子物理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（雷皓）；復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院解剖組織胚胎系（汪洋）

丁維軍，E-mail：dwj1506@hotmail.com