金小福 蔣瓊 羅心靜

丙酮酸乙酯對滑膜細胞HMGB1的影響及機制

金小福 蔣瓊 羅心靜

目的 探討丙酮酸乙酯對類風濕關(guān)節(jié)炎（RA）滑膜細胞高遷移率族蛋白-1（HMGB1）表達的影響及分子機制。 方法將培養(yǎng)的RA滑膜細胞分為正常對照組、TNF-α組和丙酮酸乙酯+TNF-α組；采用RT-PCR法檢測細胞HMGB1 mRNA表達；ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中HMGB1、IL-6和IL-8含量；采用Western blot法分別檢測滑膜細胞胞質(zhì)和核內(nèi)NF-κB變化；采用免疫熒光法觀察NF-κB在細胞中的分布。 結(jié)果 丙酮酸乙酯可抑制TNF-α誘導滑膜細胞IL-6、IL-8、HMGB1的分泌和HMGB1 mRNA的表達，以及NF-κB（p65）在滑膜細胞核內(nèi)的表達和移位。 結(jié)論 丙酮酸乙酯能下調(diào)滑膜細胞HMGB1表達和抑制NF-κB信號通路活化，可能對RA發(fā)揮抗炎作用。

類風濕關(guān)節(jié)炎 高遷移率族蛋白-1 滑膜細胞 核因子-κB 丙酮酸乙酯

類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以滑膜炎癥和關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞為特征的慢性炎癥性疾病，是造成我國人群喪失勞動力和致殘的主要疾病之一[1]。細胞因子和炎癥介質(zhì)在RA的滑膜炎癥及骨質(zhì)破壞中起到重要作用。其中，高遷移率族蛋白-1（high mobility group box chromosomal protein 1，HMGB1）作為晚期炎癥介質(zhì)，是RA病變持續(xù)存在、遷延進展的重要因素，是防治RA發(fā)生的潛在靶點[2]，而核因子（NF）-κB信號通路活化是RA時炎癥因子大量生成的分子基礎。丙酮酸乙酯能夠影響多種早期炎癥介質(zhì)的表達，在RA等關(guān)節(jié)炎癥性疾病中發(fā)揮抗炎作用。然而，丙酮酸乙酯是否影響RA晚期炎癥介質(zhì)HMGB1的表達和釋放及其機制，目前尚無報道。本研究采用TNF-α刺激人類滑膜細胞，觀察丙酮酸乙酯對HMGB1的表達和釋放及對NF-κB信號通路活化的影響，以探討丙酮酸乙酯在治療RA炎癥中的作用及機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 RA滑膜成纖維細胞（美國cell application公司）；TNF-α（美國RD公司）；TRIZOL試劑、cDNA第一鏈合成試劑盒；PCR mix（美國Life Technologies）；PCNA小鼠單克隆抗體、HMGB1兔多克隆抗體（美國BD Biosciences公司），Actin兔單克隆抗體、NF-κB（p65）兔多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；HMGB1 ELISA Kit（捷克biovendor公司）；Hoechst 33258（美國Sigma公司）；PVDF膜(美國Millipore公司)；辣根過氧化酶標記山羊抗兔IgG；Cy3標記的羊抗兔IgG（美國Sigma公司）；DAB顯色試劑盒（中國博士德生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及處理 將對數(shù)生長期的人滑膜細胞5×104個用0.25%胰酶消化后，按1×104個接種于25cm2培養(yǎng)瓶，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)24h。將細胞隨機分為3組，正常對照組：不做任何處理；TNF-α組：加10ng/ml TNF-α刺激；丙酮酸乙酯+TNF-α（EP+TNF-α）組：加5mmol/L丙酮酸乙酯與10ng/ml TNF-α共同孵育。

1.2.2 RT-PCR檢測細胞HMGB1 mRNA的表達 滑膜細胞處理6h后，采用Trizol試劑提取細胞的總RNA，紫外分光光度計測量A260nm/A280nm比值。用鳥類成髓細胞瘤病毒（AMV）逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈；用1μg的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，引物如下：HMGB1：上游引物∶5′-CCG AATTCG CTT CTG TCA ACT TCT CAG AGT TTT CC-3′，下游引物：5′-GCG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GAG GAT CCCGAA GGA GGC CTC TTG GGT GCA TTG-3′。GAPDH：上游引物：5′-AAGCCCATCACCATCTTCCA-3′。下游引物：5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′。GAPDH的PCR擴增反應條∶95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，擴增35個循環(huán)；GAPDH的PCR擴增反應條件：95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，擴增25個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。利用凝膠成像分析系統(tǒng)進行紫外光成像和圖形分析，測出各條帶的光密度值，結(jié)果以HMGB1條帶的光密度值/GAPDH條帶的光密度值表示。

1.2.3 Western blot檢測細胞NF-κB蛋白的表達 收集相應處理30min后的滑膜細胞，提取總蛋白及胞質(zhì)蛋白、核蛋白。BCA法檢測蛋白濃度。將樣品蛋白與5× SDS加樣緩沖液混合，100℃煮沸10min。樣品經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離后,電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下封閉2h后，加入NF-κB（p65）兔多克隆一抗，4℃過夜。洗去一抗后，加入辣根過氧化酶標記山羊抗兔IgG二抗，反應2h。隨后用DAB顯色，光密度掃描定量分析。

1.2.4 ELISA檢測細胞因子含量 收集相應處理24h后的滑膜細胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中HMGB1、IL-6和IL-8含量。具體操作按相應試劑盒說明書進行。

1.2.5 細胞免疫化學觀察NF-κB（p65）蛋白轉(zhuǎn)位分布 將細胞用0.25%胰蛋白酶消化，按1.0×105個細胞分別接種于鋪有滅菌干凈蓋玻片的6孔板中。細胞分別用TNF-α處理30min時間后，取出玻片，PBS清洗，多聚甲醛固定，0.3%Triton X-100通透30min，加入2%BSA封閉60min，加入NF-κB（p65）兔多克隆一抗，4℃過夜，洗去一抗后，加Cy3標記的羊抗兔IgG二抗，孵育60min，加Hoechst33258孵育2min，雙蒸水清洗5min，吸干，封片，熒光顯微鏡分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，多組間比較應用單因素方差分析，方差齊采用SNK方法，方差不齊采用Krudkal-Wallis H檢驗。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR分析滑膜細胞HMGB1表達情況 RTPCR結(jié)果顯示，與正常對照組相比，TNF-α刺激滑膜細胞6h后HMGB1 mRNA表達顯著增高；而丙酮酸乙酯能降低TNF-α所致滑膜細胞HMGB1 mRNA表達水平，詳見圖1。

2.2 Western blot檢測NF-κB（p65）在滑膜細胞核和細胞質(zhì)表達情況 Western blot結(jié)果顯示，正常對照組中，NF-κB（p65）在滑膜細胞核中表達很少，而在細胞質(zhì)中表達較多；TNF-α刺激30min后NF-κB（p65）在細胞核中表達明顯高于對照組，在細胞質(zhì)中低于對照組；而丙酮酸乙酯使NF-κB（p65）在細胞核中表達減少，而在細 胞質(zhì)中表達增多，詳見圖2。

圖1 各組滑膜細胞HMGB1表達水平（與正常對照組相比，*P＜0.05；與TNF-組相比，#P＜0.05）

圖2 各組滑膜細胞NF-κB（p65）表達水平（A：滑膜細胞核；B：滑膜細胞質(zhì)；與正常對照組相比，*P＜0.05；與TNF-α組相比，#P＜0.05）

2.3 各組細胞因子IL-6、IL-8、HMGB1含量的比較 ELISA結(jié)果顯示，TNF-α刺激滑膜細胞24h后，培養(yǎng)上清液中IL-6、IL-8、HMGB1含量顯著增多，但丙酮酸乙酯能顯著降低IL-6、IL-8、HMGB1的含量，詳見表1。

表1 各組細胞因子IL-6、IL-8、HMGB1含量的比較

2.4 細胞免疫細胞化學分析NF-κB（p65）核移位 免疫熒光細胞化學技術(shù)顯示，正常狀態(tài)下，NF-κB（p65）位于滑膜細胞質(zhì)中，滑膜細胞受TNF-α刺激30min后，NF-κB（p65）入核明顯增多；丙酮酸乙酯抑制了對TNF-α誘導的NF-κB（p65）核移位，詳見圖3。

3 討論

HMGB1是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的晚期炎癥介質(zhì)，在膿毒癥等急性炎癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[3-6]。近年來研究也表明，HMGB1與RA的發(fā)病也密切相關(guān)[7]。在RA患者或膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎模型中，HMGB1在滑膜組織均有高表達，并且與滑膜炎癥和關(guān)節(jié)破壞密切相關(guān)。在小鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射HMGB1可引起輕、中度滑膜炎癥，并誘導滑膜內(nèi)TNF-α、IL-1和IL-6含量升高；應用HMGB1抗體或重組HMGB1 box A蛋白可緩解動物實驗性滑膜炎的病情。因此，以HMGB1為靶點治療RA是目前研究的策略。

圖3 各組滑膜細胞NF-κB（p65）核移位情況

丙酮酸乙酯是一種抗氧化劑和活性氧清除劑，能與過氧化氫發(fā)生作用，同時對其它的活性氧基團如一氧化氮、羥自由基等的產(chǎn)生也有抑制作用。研究表明，丙酮酸乙酯可以顯著減輕大鼠缺血-再灌注損傷模型動物器官的結(jié)構(gòu)和功能損害，對心、肝、腎等重要生命器官有保護作用[8-9]。丙酮酸乙酯還具有抗炎作用，可調(diào)節(jié)多種早期炎癥介質(zhì)的表達和釋放，在抗膿毒癥作用中發(fā)揮重要作用，有研究證實，丙酮酸乙脂能減少膿毒癥小鼠血液中HMGB1含量，降低實驗動物的病死率[10]。最近研究發(fā)現(xiàn)，丙酮酸乙酯注射能減輕膠原性關(guān)節(jié)炎模型（CIA）大鼠或小鼠關(guān)節(jié)的腫脹程度和關(guān)節(jié)滑膜的炎癥，顯著降低大鼠血清中TNF-α、IL-6、MIP和IL-17含量，提高IL-10、TGF-β1含量，表明丙酮酸乙酯在RA等關(guān)節(jié)炎癥性疾病中亦可發(fā)揮抗炎作用[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，丙酮酸乙酯能抑制滑膜細胞晚期炎癥介質(zhì)HMGB1的表達和釋放，從細胞水平進一步證實丙酮酸乙酯的抗炎作用及機制。

NF-κB通路是調(diào)節(jié)炎癥反應的一條重要信號轉(zhuǎn)導通路。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在轉(zhuǎn)錄水平參與許多炎癥介質(zhì)基因的表達調(diào)節(jié)，是引起感染性疾病和自身免疫性疾病發(fā)生、發(fā)展的重要機制之一[13]。哺乳動物轉(zhuǎn)錄因子NF-κB主要是p65和p50亞家族蛋白結(jié)合形成的異二聚體。當細胞未受刺激時，NF-κB與其抑制蛋白ΙκB結(jié)合，以無活性的復合物形式存在于細胞質(zhì)中。當細胞受到炎性刺激時，ΙκB被激活，隨后發(fā)生磷酸化而降解。NF-κB游離出來后活性恢復，然后移位進入細胞核。在細胞核內(nèi)，NF-κB與相應的靶基因啟動子區(qū)的κB位點相結(jié)合促使炎癥介質(zhì)基因的表達。研究表明，與骨關(guān)節(jié)炎相比，NF-κB在RA滑膜組織中表達明顯升高，而且體外實驗也發(fā)現(xiàn)滑膜細胞遭受炎癥因子刺激時NF-κB活性增強[14]。為了闡明丙酮酸乙酯抑制TNF-α所致的滑膜成纖維細胞HMGB1生成的機制，本研究觀察丙酮酸乙酯對TNF-α誘導的NF-κB通路活化的影響。本研究顯示，丙酮酸乙酯能夠明顯抑制NF-κB的核移位，表明丙酮酸乙酯能抑制滑膜細胞NF-κB信號通路的活化而抑制炎癥因子HMGB1的產(chǎn)生和分泌。

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Effect of ethyl pyruvate on expression of HMGB1 in synoviocytes of rheumatoid arthritis

ObjectiveTo investigate the effects of ethyl pyruvate(EP)on the expression of high mobility group box chromosomal protein 1(HMGB1)in synoviocytes of rheumatoid arthritis(RA)and its molecular mechanism．Methods RA synoviocytes were cultured and divided into normal control group,TNF-a group,EP+TNF-α group．The expression of HMGB1 mRNA in cultured synoviocytes was determined by RT-PCR．HMGB1 concentrations in culture supernatants were measured with enzyme-linked immunosorbent assays(ELISA)．Nuclear translocation of NF-κB was examined by Western blotting and immunohistochemistry．Results EP down-regulated HMGB1 mRNA expression and secretion in RA synoviocytes induced by TNF-a．EP inhibited nuclear translocation of NF-κB in RA synoviocytes induced by TNF-α．Conclusion EP has an anti-inflammatory effect on RA by down-regulation of HMGB1 in synoviocytes,which may be associated with inhibiting the activation of NF-κB signal pathways．

Rheumatoid arthritis High mobility group box chromosomal protein 1 Synoviocytes NF-κB Ethyl pyruvate

2014-02-19）

（本文編輯：嚴瑋雯）

臺州市椒江區(qū)科技項目（122095）

318000 臺州學院附屬市立醫(yī)院腎病和風濕免疫科（金小福、蔣瓊）；臺州學院醫(yī)學院腫瘤研究所（羅心靜）

羅心靜，E-mail：luoxjing@126.com