殷秀辰，哈 卓，李 星，張清真，劉惠莉

（1. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201106；2. 上海佳牧生物制品有限公司，上海 201106）

含粘膜佐劑的雞新城疫疫苗誘導(dǎo)雛雞非特異性免疫應(yīng)答的研究

殷秀辰1,2，哈 卓1，李 星1，張清真1，劉惠莉1,2

（1. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201106；2. 上海佳牧生物制品有限公司，上海 201106）

為研究分析重組大腸桿菌不耐熱腸毒素（labile enterotoxin，LT）作為粘膜佐劑，配伍雞新城疫疫苗的凍干樣品對(duì)免疫雞非特異性免疫應(yīng)答的影響，在前期已經(jīng)構(gòu)建的LTR72/G192基礎(chǔ)上，選擇2、4 μg LTRG蛋白作為每羽份疫苗添加量，及降低新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV） 50%抗原量等配伍條件。按照生產(chǎn)條件制備凍干疫苗，進(jìn)行雛雞免疫試驗(yàn)，免疫后24、48、72 h采集脾臟、胸腺淋巴結(jié)，檢測(cè)幾種非特異性細(xì)胞因子表達(dá)水平。結(jié)果表明：IL-6、INF-γ水平在各疫苗免疫后24 h即升高，48 h達(dá)最高值；添加2、4 μg LTRG蛋白的NDV疫苗組IFN-β、TNF-α水平在48 h左右顯著升高，其中含4 μg LTRG疫苗組與其他組差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；IL-6、IFN-γ轉(zhuǎn)錄水平有所增強(qiáng)，但各組間差異不具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），72 h左右?guī)追N細(xì)胞因子水平均迅速下降，與NDV疫苗接種組相近。由此可見(jiàn)，LTRG能輔助抗原誘導(dǎo)免疫雛雞的非特異性免疫應(yīng)答，有利于對(duì)感染病毒的清除。

LTRG；新城疫病毒；佐劑；細(xì)胞因子

大腸桿菌不耐熱腸毒素（labile enterotoxin，LT）是產(chǎn)腸毒素大腸桿菌分泌的一種毒素蛋白，被認(rèn)為是最具潛力的黏膜佐劑[1-3]。但LT的毒性限制了其應(yīng)用，采用點(diǎn)突變可獲得減毒甚至無(wú)毒的LT突變體，從而制備無(wú)毒LT蛋白[4]。

本實(shí)驗(yàn)室之前已經(jīng)對(duì)LT進(jìn)行了雙突變體并成功表達(dá)了該蛋白，命名為L(zhǎng)TRG（R72/G192），對(duì)重組蛋白的生物學(xué)特性、免疫佐劑活性進(jìn)行了相關(guān)研究[5]，主要針對(duì)其與疫苗共免疫后的黏膜抗體IgA，血清抗體IgG的一些特異性免疫應(yīng)答方面進(jìn)行的評(píng)價(jià)。

非特異性免疫是機(jī)體在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中與病原微生物相互作用，逐漸建立起來(lái)的一系列防御功能。宿主的抗病原應(yīng)答反應(yīng)強(qiáng)度與干擾素（interferon，IFN）及腫瘤細(xì)胞壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等細(xì)胞因子的濃度密切相關(guān)[6]。IFN是一種類似多肽激素的物質(zhì)，具有廣譜抗病毒和細(xì)胞調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子。TNF是由巨噬細(xì)胞分泌的一種小分子蛋白，具有多種生物學(xué)功能，與抑制病毒復(fù)制、病毒顆粒的產(chǎn)生和感染性方面關(guān)系密切，并可殺傷病毒感染細(xì)胞[6,7]。白細(xì)胞介素（interleukin，IL）在免疫過(guò)程中也能夠激活和調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，能夠介導(dǎo)T、B淋巴細(xì)胞的活化、增殖及分化[8]。

本文采用LTRG蛋白與新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）活疫苗配伍免疫雛雞，通過(guò)熒光定量PCR分別檢測(cè)IFN、TFN以及IL-6的水平，研究LTRG對(duì)非特異性免疫應(yīng)答的影響。

1 材料方法

1.1 材料新城疫活疫苗（NDV，LaSota）為上海海利公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：1206016，病毒效價(jià)為109.75TCID50；凍干保護(hù)劑：10%牛奶保護(hù)劑，批號(hào)：20121129；LTRG蛋白為本實(shí)驗(yàn)室純化保存，濃度為1 mg/mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 凍干樣品制備 采用PBS將新城疫疫苗稀釋，終濃度為2羽份/mL凍干疫苗1：NDV疫苗抗原與LTRG蛋白比例為1.5:4；凍干疫苗2：NDV疫苗抗原與LTRG蛋白比例為1.5:2；凍干疫苗3：NDV疫苗抗原與LTRG蛋白比例為1.5:4。

1.2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 50羽1日齡雛雞飼養(yǎng)于消毒的潔凈環(huán)境中，不接種任何疫苗及藥物，至7日齡按表1分組，滴鼻免疫。

免疫后24、48、72 h每組分別處死2只雞，采胸腺淋巴結(jié)和脾臟，用于檢測(cè)細(xì)胞因子。

1.2.3 熒光定量PCR方法建立

1.2.3.1 引物設(shè)計(jì)及PCR體系和退火溫度的篩選 根據(jù)GenBank中登錄的雞細(xì)胞因子IFN-β、IFN-γ、TNF-α、IL-6核苷酸序列，選擇保守序列區(qū)作為擴(kuò)增區(qū)域，采用BLAST軟件程序和Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工生物工程公司合成，信息見(jiàn)表2。

表1 雛雞試驗(yàn)分組Table 1 The group of chickens

表2 Real-time PCR 所用引物及產(chǎn)物片段長(zhǎng)度Table 2 The primers used in Real-time PCR and length of fragment

通過(guò)優(yōu)化各組分比例及退火溫度等條件，建立PCR反應(yīng)體系。20 μL反應(yīng)液：模板1 μL、buffer 2 μL，上游引物終濃度為200 nmol/L，下游引物終濃度為200 nmol/L。

分別采用64.0℃、63.1℃、61.5℃、58.9℃、55.3℃、52.8℃、51.1℃和50.0℃ 8個(gè)溫度梯度對(duì)Real-time PCR反應(yīng)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)溫度。

1.2.3.2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 提取健康雞脾臟RNA，采用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增各細(xì)胞因子基因，回收克隆至T載體，經(jīng)序列測(cè)定正確后，作為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋100倍，測(cè)定質(zhì)粒濃度，并根據(jù)公式轉(zhuǎn)化為測(cè)定樣品中的質(zhì)?？截悢?shù)。將拷貝數(shù)為2×108的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，共稀釋5個(gè)梯度：2×108～2×103copies/μL。用優(yōu)化的Realtime PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增不同濃度模板繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 Real-time PCR檢測(cè)采用Trizol提取采集的雞脾臟和胸腺淋巴結(jié)組織IFN-β、IFN-γ、TNF-α、IL-6 RNA，加入DEPC水溶解后反轉(zhuǎn)錄，通過(guò)建立的Real-time PCR對(duì)其轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)。采用優(yōu)化的反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增。通過(guò)相對(duì)定量的分析，比較不同免疫組之間引起的細(xì)胞因子的組間差異表達(dá)。結(jié)果采用SPSS軟件進(jìn)行差異統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 最佳循環(huán)參數(shù)確定經(jīng)優(yōu)化，定量PCR擴(kuò)增條件如下：95℃度預(yù)變性2 min；95℃ 變性15 s，57℃退火30 s，延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。PCR儀于延伸階段采集熒光信號(hào)。

2.2 細(xì)胞因子擴(kuò)增與溶解曲線四種細(xì)胞因子擴(kuò)增效果理想，擴(kuò)增曲線均在理想循環(huán)參數(shù)內(nèi)。溶解曲線重合率高，顯示擴(kuò)增目的基因均一性好（圖1）。

2.3 胸腺淋巴結(jié)細(xì)胞因子檢測(cè)對(duì)IFN-β、IFN-γ、TNF-α、IL-6四種細(xì)胞因子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，免疫后d 2，第一、二組細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄均明顯上升，其中第一組配伍疫苗IFN-γ、TNF-α、IL-6與疫苗組差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖2）。結(jié)果表明，2、4 μg LTRG 均能促進(jìn)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)非特異性免疫應(yīng)答能力。

2.4 脾臟細(xì)胞因子檢測(cè)雛雞免疫后，檢測(cè)脾臟細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫后24 h，4 μg LTRG免疫劑量能顯著增強(qiáng)IFN-β轉(zhuǎn)錄水平，與NDV對(duì)照組差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；免疫后48 h，IFN-γ、IL-6 轉(zhuǎn)錄水平顯著增強(qiáng)，高于2 μg LTRG添加組及NDV疫苗組，但差異不具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；免疫后72 h，4 μg LTRG 添加疫苗組TNF-α轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，與NDV疫苗組差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

圖1 四種細(xì)胞因子擴(kuò)增圖Fig.1 The amplifi cation of four cytokines by Real-time PCR

3 討論

佐劑（Adjuvant）是一類先于抗原或與抗原同時(shí)注入機(jī)體，從而非特異性地增強(qiáng)或者改變機(jī)體對(duì)抗原免疫應(yīng)答的物質(zhì)[9,10]。佐劑誘導(dǎo)抗原提呈細(xì)胞（APC）分泌細(xì)胞因子，可刺激CD4+T細(xì)胞分化為Thl與Th2兩種亞型。其中Thl細(xì)胞可以分泌白細(xì)胞介素2 （IL-2）以及干擾素γ(IFN-γ)，促進(jìn)B細(xì)胞特異性抗體IgG2的分泌，并介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。Th2細(xì)胞能夠產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6以及IL-10，以促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生高水平的IgG和IgE[8,11]。

干擾素的主要作用是抗病毒及免疫調(diào)節(jié)[7]。研究證實(shí)，感染發(fā)生前，IFN-β有預(yù)防作用；感染發(fā)生后，IFN-β有治療作用[12]。IFN-γ可使巨噬細(xì)胞表面MHCⅡ類分子的表達(dá)增加，增強(qiáng)其抗原遞呈能力；此外還能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞表面表達(dá)Fc受體，促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬免疫復(fù)合物、抗體包被的病原體和腫瘤細(xì)胞。IFN-γ對(duì)B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的分化有促進(jìn)作用等，尤其是IFN-γ能增強(qiáng)TH1細(xì)胞的活性，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能[13,14]。

圖2 胸腺淋巴結(jié)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)Fig.2 The detection result of the cytokines of thymus lymph node by Real-time PCR

圖3 脾臟細(xì)胞因子定量檢測(cè)Fig.3 The quantitative detection of the cytokines in spleens

本研究采用Real-time PCR對(duì)胸腺和脾臟的IFN-β、IFN-γ、TNF-α、IL-6進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，4種細(xì)胞因子在添加LTRG組中的轉(zhuǎn)錄情況要明顯高于未添加組。胸腺中，4種細(xì)胞因子的水平在各疫苗免疫后48 h達(dá)最高值，含4 μg LTRG疫苗組與其他組差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在脾臟中，含4 μg LTRG疫苗組與其他組差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，添加2 μg LTRG疫苗組與其他差異不具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明LTRG蛋白可以增強(qiáng)機(jī)體對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答能力，誘導(dǎo)各種細(xì)胞因子的表達(dá)顯著增加。同時(shí)，細(xì)胞因子能夠刺激B淋巴細(xì)胞的分泌抗體，較高的細(xì)胞因子能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生較高的抗體水平。本研究結(jié)果證明含有LTRG疫苗佐劑的新城疫疫苗能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生較高的非特異性免疫反應(yīng)，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用。

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ADDITION OF HEAT-LABILE ENTEROTOXIN AS ADJUVANT TO NEWCASTLE DISEASE VACCINE ENHANCES NON-SPECIFIC IMMUNE RESPONSES IN CHICKENS

YIN Xiu-chen1,2,HA Zhuo1,LI Xing1,ZHANG Qing-zhen1,LIU Hui-li1,2
(1. Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetic Breeding,Institute of Animal Science and Veterinary Medicine,Shanghai Academy of Agricultural Science,Shanghai 201106,China; 2. Shanghai Jiamu Bio-product Co. Ltd.,Shanghai 201106,China)

In the present study,heat-labile enterotoxin (LT) was used as adjuvants for Newcastle disease virus (NDV) vaccine to investigate if non-specifi c immune responses were enhanced in vaccinated chickens. The formulation procedure was to add 2 μg or 4 μg LTRG to one dose of NDV vaccine or 4 μg LTRG to half dose of vaccine followed by freeze-drying cycles. The aduvanted NDV vaccines were orally administered to chickens. At 24,48 h and 72 h post vaccination,spleens,thymuses and lymph nodes were collected and levels of IL-6,INF-γ,IFN-β and TNF-α were detected in Real-time PCR. The results showed that IL-6 and INF-γ of all vaccinated chickens started to rise at 24 h and peaked at 48 h post vaccination while IFN-β and TNF-α did not signifi cantly increase till 48 h post vaccination.In addition,chickens vaccinated with NDV vaccine containing 4 μg LTRG developed significantly (P＜0.01) higher IL-6 and INF-γ responses than NDV alone controls. The transcription levels of IL-6 and INF-γ increased but difference among groups was not signifi cant (P＞0.05). In conclusion,addition of LTRG to NDV vaccine enhanced non-specifi c immune responses in vaccinated chickens.

LTRG; Newcastle disease virus; adjuvant; cytokines

S852.659.5

A

1674-6422（2014）05-0035-06

2014-07-05

上海市科委農(nóng)業(yè)成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（1239019N0800）；上海市農(nóng)委攻關(guān)項(xiàng)目（滬農(nóng)科攻字(2008)第8-6號(hào)；滬農(nóng)科攻字(2010)第2-4號(hào)）

殷秀辰，男，碩士，主要從事病毒分子生物學(xué)和免疫學(xué)的研究

劉惠莉，E-mail：huilil@163.com