余 磊，閆大為，高旭元，肖亞莉，劉紹瓊，李雪松，閆麗萍，滕巧泱，李國新，李澤君

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

·研究論文·

鴨坦布蘇病毒E蛋白結(jié)構(gòu)域III原核表達產(chǎn)物誘導(dǎo)中和抗體的研究

余 磊，閆大為，高旭元，肖亞莉，劉紹瓊，李雪松，閆麗萍，滕巧泱，李國新，李澤君

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

黃病毒E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ能夠介導(dǎo)病毒與宿主受體結(jié)合以及誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，本研究利用原核表達系統(tǒng)表達了鴨坦布蘇病毒E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ，并研究了其免疫原性。按照大腸桿菌偏好性密碼子對鴨坦布蘇病毒E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ核苷酸序列進行優(yōu)化并合成后，克隆至pCold-TF載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pCold-TF-optiEDIII。Western blot證實重組蛋白能與鴨坦布蘇病毒特異性血清發(fā)生反應(yīng)。用純化的重組蛋白免疫BLAB/c小鼠3次，間接ELISA和間接免疫熒光實驗證實E蛋白結(jié)構(gòu)Ⅲ誘導(dǎo)了鴨坦布蘇病毒特異性的體液免疫反應(yīng)。中和實驗證實鴨坦布蘇病毒E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。本研究為進一步研制鴨坦布蘇病毒診斷抗原和亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。

鴨坦布蘇病毒；E蛋白；結(jié)構(gòu)域III；中和抗體

鴨坦布蘇病毒病是由鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusu virus, DTMUV）引起的一種以蛋鴨產(chǎn)蛋下降為主要特征的傳染病。2010年，鴨坦布蘇病毒病在我國南方部分地區(qū)首次發(fā)生，之后蔓延到全國大部分鴨養(yǎng)殖地區(qū)[1-4]。其主要臨床上表現(xiàn)為高熱、食欲廢絕、產(chǎn)蛋下降甚至停止，死亡率可達5%～10%[4]。該病傳播迅速且發(fā)病范圍廣，給我國蛋鴨和種鴨養(yǎng)殖造成了極大經(jīng)濟損失。

鴨坦布蘇病毒屬于黃病毒科、黃病毒屬，其基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，核苷酸長度約為11 kb，含有單一的開放閱讀框，編碼結(jié)構(gòu)蛋白（C、PrM和E）和非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5）[5,6]。其中，E蛋白是DTMUV主要表面結(jié)構(gòu)蛋白，包含許多與宿主嗜性、宿主細(xì)胞膜融合及宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合相關(guān)的抗原表位[7-9]。根據(jù)其功能不同，E蛋白分為三個結(jié)構(gòu)域（I、II和III），而成免疫球蛋白樣的第三結(jié)構(gòu)域（EDIII）位于病毒最外層，在介導(dǎo)病毒與宿主受體結(jié)合中具有重要的作用，同時也是誘導(dǎo)中和抗體的優(yōu)勢表位區(qū)域[10,11]。因此，對EDIII的表達和功能研究，對病毒與宿主細(xì)胞的相互作用，臨床診斷和亞單位疫苗研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病毒株、質(zhì)粒和實驗動物DTMUV奉賢分離株（FX2010）為本研究室分離、鑒定及保存；pCold-TF載體為TaKaRa 公司產(chǎn)品；DF-1細(xì)胞為上海獸醫(yī)研究所禽傳染病研究室（以下簡稱本研究室）保存；DTMUV的鴨陽性血清和DTMUV E蛋白的單克隆抗體（mAB）1F5由本研究室制備并保存；6周齡雌性BLAB/c小鼠購自上海斯萊克實驗動物公司。

1.2 主要試劑限制性內(nèi)切酶、蛋白Marker和DNA Marker購自TaKaRa 公司；質(zhì)粒小提試劑盒和DNA膠回收試劑盒購自德國AXYGEN公司；Ni-NTA Agarose購自上海悅克生物技術(shù)有限公司；TMB顯色液購自武漢博士德公司；熒光標(biāo)記羊抗鼠IgG（FITC-IgG）、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗鴨IgG為KPL公司產(chǎn)品；SuperSignal?West Pico Chemiluminescent Substrate為Thermo公司產(chǎn)品。

1.3 密碼子優(yōu)化DTMUV EDIII的核苷酸序列含有多個大腸桿菌稀有密碼子，這可能會影響蛋白在原核系統(tǒng)中的高效表達。為了提高蛋白的表達量，本研究在不改變氨基酸序列前提下，對編碼E蛋白第三結(jié)構(gòu)域（EDIII）核苷酸序列進行優(yōu)化，把大腸桿菌稀有密碼子改變?yōu)榇竽c桿菌偏好性密碼子，并在該基因的上游引入BamH I酶切位點，下游引入Hind Ⅲ酶切位點。優(yōu)化后的基因序列由英駿生物技術(shù)有限公司合成，命名為optiEDⅢ。

1.4 原核表達載體構(gòu)建將含有優(yōu)化基因optiEDⅢ的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III 進行消化，與經(jīng)相同酶消化的pCold-TF載體連接，連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落擴增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后用BamH I 和Hind III 雙酶切進行鑒定。將篩選到的陽性質(zhì)粒進行測序以驗證序列的正確性，陽性質(zhì)粒命名為pCold-TF-optiEDIII。

1.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達將陽性質(zhì)粒pCold-TF-optiEDIII轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種于含Amp的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)，待菌液OD值達到0.6～0.8時，加入1 mmoL IPTG，靜置30 min，15℃低溫誘導(dǎo)24 h。將培養(yǎng)物4℃5600×g離心10 min，用1 mL PBS懸起管底菌液，置冰上裂解超聲，4℃、5600×g離心10 min，取上清，分析表達產(chǎn)物。

1.6 SDS-PAGE和Western blot鑒定表達產(chǎn)物用10%的分離膠，將表達產(chǎn)物以每孔15 μL的上樣量進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，凝膠經(jīng)考馬斯亮藍R-250染色。另一部分凝膠轉(zhuǎn)印至PVDF膜，采用5%脫脂乳封閉2 h，以抗DTMUV鴨陽性血清（1∶100）和His單抗（1∶1000）37℃孵育2 h，PBST洗5次，用羊抗鴨HRP-IgG（1∶ 5000）或羊抗鼠HRP-IgG（1∶10 000）為二抗，37℃孵育1 h。最后采用ECL顯色和壓片曝光。

1.7 重組蛋白的純化將陽性克隆單菌落接種于含Amp的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)至適當(dāng)濃度，再按1%接種至200 mL LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，待菌液OD值達到0.6時，加入1 mmol/IPTG，靜置30 min后，15℃低溫誘導(dǎo)24 h。培養(yǎng)物4℃、5600×g離心10 min，用10 mLPBS懸起管底菌液，置冰上裂解超聲，4℃、5600×g離心10 min，取上清。將收集的上清液4℃用Ni-NTA Agarose柱進行純化，用含不同濃度咪唑的洗脫液進行滴度洗去雜蛋白，最后用400 mmol/L咪唑洗脫目的蛋白。純化后的蛋白用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白含量。

1.8 BALB/c小鼠免疫將BALB/c小鼠隨機分成兩組，每組5只。將50 μg融合蛋白和50 μg pCold-TF空載體蛋白與等體積的弗式佐劑乳化后，每3周腹腔注射免疫1次，共免疫3次，最后1次免疫后10 d采血，分離血清用于抗體檢測。

1.9 間接ELISA檢測血清抗體間接ELISA檢測按參考文獻[12]進行，將小鼠免疫血清1∶100倍稀釋后加入到包被好的全病毒ELISA板中，同時設(shè)載體蛋白免疫血清（5份血清等體積混合）和小鼠陰性血清對照，37℃孵育1 h，PBST洗3次，每次5 min；加入1∶5000倍稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37℃孵育1 h，PBST洗3次；用TMB顯色液避光顯色10 min，用2 mol/L濃H2SO4終止后，測定OD450。

1.10 間接免疫熒光試驗 (indirect immunof uorescene assay, IFA) 檢測血清抗體長滿單層DF-1細(xì)胞的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種1000 TCID50的DTMUV（FX2010株）病毒，培養(yǎng)24 h后，用4%多聚甲醛固定，用1%BSA封閉0.5 h，加入小鼠免疫血清，同時設(shè)載體蛋白免疫血清（5份血清等體積混合）和小鼠陰性血清對照，室溫孵育1.5 h，以1∶200倍稀釋的羊抗鼠FITC-IgG 37℃孵育1 h，PBS洗4次，在熒光顯微鏡下觀察。

1.11 中和抗體檢測將5份小鼠免疫血清等體積混合后，56℃滅活30 min，同時用小鼠高免血清和陰性血清作為對照。用含2%的FBS細(xì)胞維持液作為稀釋液，將血清作2倍梯度稀釋，與等體積的100TCID50病毒液混合，37℃孵育1.5 h。將50 μL混合液加入DF-1細(xì)胞長成單層的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃孵育1.5 h。培養(yǎng)24 h，棄維持液，用4%多聚甲醛固定15 min，用0.5%Triton-100通透15 min，加入1∶400稀釋的抗鴨坦布蘇病毒單抗1F5，37℃孵育1 h后，用PBS洗3次，每次5 min。最后用1∶200倍稀釋的熒光標(biāo)記羊抗鼠FITC-IgG為二抗孵育，在熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 編碼鴨坦布蘇病毒E蛋白結(jié)構(gòu)域III核苷酸序列的優(yōu)化序列優(yōu)化過程中，在不改變氨基酸序列的條件下，盡量采用大腸桿菌常用的密碼子，優(yōu)化前后序列的相似性為71.9%（圖1）。

圖1 鴨坦布蘇病毒EDIII基因密碼子優(yōu)化前后的序列Fig.1 The sequences of the original and codon-optimized EDIII genes from DTMUV

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定構(gòu)建的質(zhì)粒用BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定，電泳后，可以見到約350 bp左右和約5700 bp的片段，與預(yù)期大小相一致（圖2）。重組質(zhì)粒pCold-TF-optiEDIII經(jīng)測序，結(jié)果和原序列完全一致。

2.3 SDS-PAGE和Western blot鑒定重組蛋白將重組質(zhì)粒pCold-TF-optiEDIII轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)低溫誘導(dǎo)后，將裂解物上清液進行SDS-PAGE電泳。結(jié)果顯示在約70 kDa處出現(xiàn)明顯條帶，與預(yù)期大小一致，表明目的蛋白為可溶性表達（圖3）。Western blot分析結(jié)果顯示，目的蛋白與鴨坦布蘇病毒陽性血清反應(yīng)，也與His單抗發(fā)生反應(yīng)，在約70 kDa處出現(xiàn)明顯條帶（圖4），而對照的載體蛋白無特異性條帶，表明表達的目的蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

圖2 BamH I and Hind III酶切鑒定重組質(zhì)粒Fig.2 Identif cation of the recombinant plasmid digested with BamH I and Hind III

圖3 SDS-PAGE分析重組蛋白Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant protein

圖4 用鴨坦布蘇病毒血清（A）和His單抗（B）檢測重組蛋白Fig.4 Western blot analysis of the recombinant protein with the duck serum against DTMUV(A) and anti-His monoclonal antibody(B)

2.4 間接ELISA和IFA檢測重組蛋白免疫小鼠血清用全病毒ELISA和間接免疫熒光試驗檢測EDIII免疫小鼠血清，同時用載體蛋白免疫小鼠血清和小鼠陰性血清作為對照。ELISA檢測結(jié)果顯示，EDIII免疫小鼠抗體水平明顯高于對照組（圖5）。間接免疫熒光試驗檢測結(jié)果顯示，EDIII免疫小鼠血清可與病毒發(fā)生特異性反應(yīng)，病毒感染細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。而載體蛋白免疫小鼠血清和小鼠陰性血清都無特異性熒光（圖6）。上述結(jié)果表明，重組蛋白EDIII能刺激機體產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答，具有良好的免疫原性。

圖5 間接ELISA檢測重組蛋白EDIII免疫小鼠血清Fig.5 Detection of the sera from EDIII-immunized mice by indirect ELISA

圖6 間接免疫熒光試驗檢測重組蛋白EDIII免疫小鼠血清Fig.6 Detection of the sera from EDIII-immunized mice by indirect IFA

2.5 微量血清中和試驗檢測免疫小鼠血清將EDIII重組蛋白和載體蛋白免疫的小鼠血清分別從1∶2開始做梯度稀釋，稀釋后的樣品與等體積100TCID50病毒液混合感作后，用抗病毒單抗檢測感染細(xì)胞的病毒。結(jié)果顯示，EDIII重組蛋白免疫小鼠血清從1∶16開始可見綠色熒光，而載體蛋白免疫小鼠血清和小鼠陰性血清所有孔均可見綠色熒光（圖7）。表明EDIII重組蛋白免疫血清具有中和活性。

圖7 微量中和試驗檢測重組蛋白EDIII免疫小鼠中和抗體Fig.7 Detection the neitralization antibody of sera from EDIII-immunized mice by the icroneutralization test

3 討論

鴨坦布蘇病毒與其他黃病毒一樣，具有相似的E蛋白結(jié)構(gòu)。E蛋白胞外區(qū)包含的三個結(jié)構(gòu)域功能各異，位于中心的呈β桶裝結(jié)構(gòu)的第一結(jié)構(gòu)域參與病毒入侵宿主細(xì)胞時構(gòu)象改變；第二結(jié)構(gòu)域決定二聚體形成內(nèi)融合肽，而作為潛在受體結(jié)合區(qū)的免疫球蛋白樣的第三結(jié)構(gòu)域，其功能顯得極為重要。乙型腦炎病毒、西尼羅病毒和登革熱病毒等許多關(guān)于黃病毒第三結(jié)構(gòu)域的研究都表明，重組表達EDIII蛋白具有良好的免疫原性，并且能夠刺激機體產(chǎn)生中和抗體和為宿主提供有效的免疫保護[13-15]。本研究中原核表達的重組蛋白EDIII在免疫小鼠后能刺激產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生的抗體能中和病毒，阻斷其侵染易感細(xì)胞。這預(yù)示著鴨坦布蘇病毒EDIII具有良好的免疫原性，可以作為研制亞單位疫苗的候選結(jié)構(gòu)區(qū)域。

以大腸桿菌為宿主的原核表達系統(tǒng)，由于其繁殖快、成本低等優(yōu)點而被廣泛使用。然而密碼子對于宿主具有偏嗜性，不同宿主密碼子的使用頻率不同，經(jīng)常會影響異源基因在宿主中的表達[16-18]。在本研究中，我們對編碼鴨坦布蘇病毒E基因結(jié)構(gòu)域III的核苷酸序列進行了優(yōu)化，使目的蛋白獲得了高效表達。另外，密碼子偏性只是影響蛋白表達的因素之一，載體的選擇也很重要。我們將優(yōu)化后的序列連接到pET-28a表達載體中，目的蛋白也得到了表達，但是非可溶性的，而且表達量明顯低于pCold-TF表達載體。本研究選用的pCold-TF表達載體使目的蛋白得到了高效可溶性表達，并且證明其具有良好的免疫原性，為進一步研究鴨坦布蘇病毒E蛋白結(jié)構(gòu)域III的結(jié)構(gòu)與功能奠定了良好的基礎(chǔ)。

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PROKARYOTIC EXPRESSION OF DOMAIN III OF ENVELOPE PROTEIN OF DUCK TEMBUSU VIRUS AND CHARACTERIZATION OF NEUTRALIZING ANTIBODY RESPONSES

YU Lei, YAN Da-wei, GAO Xu-yuan, XIAO Ya-li, LIU Shao-qiong, LI Xue-song, YAN Li-ping, TENG Qiao-yang, LI Guo-xin, LI Ze-jun
(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The domain III of envelope glycoprotein (E) of the f aviviruses has been shown to bind cellular receptors and elicit neutralizing antibodies. In the present study, recombinant domain III (DIII) of E protein of Duck Tembusu virus (DTMUV) was expressed in E. coli and its immunogenicity was evaluated using BALB/c mouse model. The coding sequence of DIII was optimized (optiDIII) according to the bias codon usages of E.coli and then cloned into the multiple cloning site of pCold-TF vector to construct the recombinant plasmid pCold-TF-optiDIII. Western blot analysis showed the recombinant protein could react specif cally with DTMUV antiserum. The recombinant DIII was purif ed and used to immunize BALB/c mice three times. The humoral immune responses specif c for DTMUV were demonstrated by ELISA and indirect immunof uorescene assay(IFA). Importantly, neutralizing antibodies against DTMUV were detected in mouse serum samples by microneutralizing test. These f ndings have indicated that the recombinant DIII can be used for development of diagnostic reagents and subunit vaccines of DTMUV.

Duck Tembusu virus; envelope protein; domain III; neutralizing antibody

S852.659.6

A

1674-6422（2014）02-0001-06

2014-02-14

自然科學(xué)基金（面上）項目（31172332）；上海市科技興農(nóng)重點攻關(guān)項目（滬農(nóng)科攻字（2012）第2-6號）；上海市科委“創(chuàng)新行動計劃”基礎(chǔ)研究重點項目（12JC1410600）；上海市科委“創(chuàng)新行動計劃”現(xiàn)代農(nóng)業(yè)領(lǐng)域重點科技攻關(guān)項目（13391901601）

余磊，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

李澤君，E-mail：lizejun@shvri.ac.cn；李國新，E-mail：guoxinli@shvri.ac.cn