侯灣灣，韓先干，王少輝，王小蘭，岳嘉蘋(píng)，曹守林，范紅結(jié)，于圣青

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，南京 210095；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

鴨疫里默氏桿菌GroEL蛋白的原核表達(dá)和單克隆抗體制備

侯灣灣1,2，韓先干2，王少輝2，王小蘭2，岳嘉蘋(píng)2，曹守林2，范紅結(jié)1，于圣青2

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，南京 210095；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

本試驗(yàn)旨在研制鴨疫里默氏桿菌GroEL蛋白的單克隆抗體。將鴨疫里默氏桿菌WJ4菌株的groEL基因進(jìn)行原核表達(dá)，重組蛋白經(jīng)過(guò)純化后作為免疫原免疫BALB/c小鼠。經(jīng)過(guò)3次免疫后，取免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，用間接ELISA篩選陽(yáng)性細(xì)胞株并進(jìn)行3次亞克隆后制備小鼠腹水單克隆抗體。共獲得2株穩(wěn)定分泌鴨疫里默氏桿菌GroEL單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1G2B6和1G2F10。2株單克隆抗體均為IgG1亞類(lèi)。腹水單克隆抗體ELISA效價(jià)達(dá)到1:102 400。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明2株單克隆抗體均能與鴨疫里默氏桿菌血清1、2和10型菌株發(fā)生特異性結(jié)合，而與禽致病性大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和禽巴氏桿菌菌株無(wú)反應(yīng)性。本研究成功制備了穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)的鴨疫里默氏桿菌GroEL單克隆抗體，為進(jìn)一步研制基于抗體檢測(cè)鴨疫里默氏桿菌抗原的試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

鴨疫里默氏桿菌；GroEL蛋白；單克隆抗體

Key words：Riemerella anatipestifer; GroEL; monoclonal antibody

鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer,RA）是鴨傳染性漿膜炎的病原體，鴨、火雞等禽類(lèi)感染該病多呈急性或慢性敗血癥，特征病變?yōu)槔w維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎、干酪樣輸卵管炎等，是目前危害禽類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)的主要傳染病之一。

檢測(cè)鴨疫里默氏桿菌的血清學(xué)反應(yīng)有間接血凝試驗(yàn)、平板凝集、試管凝集和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)等。用裂解的全菌蛋白[1]和外膜蛋白[2]作為包被抗原建立的ELISA方法能檢測(cè)出鴨疫里默氏桿菌抗體。檢測(cè)鴨疫里默氏桿菌的分子生物學(xué)方法主要有基于該菌16S rRNA[3]和OmpA[4]的PCR方法，基于莢膜多糖基因序列的Real-time PCR[5]以及基于groEL的 LAMP[6]方法等。目前用單克隆抗體檢測(cè)鴨疫里默氏桿菌的方法鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，GroEL是血清1、2和10 型鴨疫里默氏桿菌的一種共同免疫原性蛋白[7]。本研究通過(guò)構(gòu)建鴨疫里默氏桿菌的GroEL蛋白的原核表達(dá)載體表達(dá)獲得GroEL重組蛋白，免疫BALB/c小鼠后，制備單克隆抗體。ELISA和Western blot檢測(cè)結(jié)果表明獲得的2株單克隆抗體效價(jià)高，對(duì)血清1、2和10型鴨疫里默氏桿菌菌株具有交叉反應(yīng)性，與禽致病性大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和禽巴氏桿菌菌株無(wú)反應(yīng)性。該研究為鴨疫里默氏桿菌檢測(cè)試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料所用菌株及來(lái)源如表1所示。SP2/0骨髓瘤細(xì)胞、pET-28a（+）質(zhì)粒由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所公共衛(wèi)生研究室（以下簡(jiǎn)稱(chēng)本實(shí)驗(yàn)室）保存；BALB/c小鼠購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；HT、HAT、聚乙二醇和弗氏佐劑購(gòu)自Sigma公司；RPMI1640和胎牛血清購(gòu)自BIOWEST公司；T4 DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)、普通質(zhì)粒小提試劑盒、異丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）、可溶型單組分TMB底物溶液、DAB增強(qiáng)型底物顯色試劑盒、羊抗鼠的IgG-HRP為天根生化科技有限公司產(chǎn)品；His-Binding-Resin親和層析Ni柱購(gòu)自上海悅克生物科技公司；膠回收試劑盒、產(chǎn)物純化試劑盒、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Fermentas公司；BCA試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；小鼠單克隆抗體分型試劑盒SBA ClonotypingTMSystem/HRP購(gòu)自Southern Biotech公司；單抗純化試劑盒HiTrap Protein G HP為GE Healthcare Life Sciences公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 鴨疫里默氏桿菌GroEL原核表達(dá)及純化

1.2.1.1 鴨疫里默氏桿菌GroEL原核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)GenBank中鴨疫里默氏桿菌groEL基因序列（1629 bp，GenBank登錄號(hào)：GU060633.1），設(shè)計(jì)一對(duì)引物，引物兩端添加BamH I和SalI酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基，其中引物上游序列為5'-CAGGATCCA TGGCAAAAGATATTAAATTTGATATA-3'，下游序列為5'-CTGTCGACTTACATCATACCTGGCATT CC-3'。

提取鴨疫里默氏桿菌WJ4的基因組，作為PCR模板擴(kuò)增groEL基因，反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min；95℃ 1 min，58℃ 2 min，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段，并以BamH I和SalI酶切，回收目的片段與經(jīng)同樣酶切處理的pET-28a（+）載體連接，并將pET28a-groEL轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α宿主菌。利用卡那抗性和限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行重組菌的篩選和鑒定。重組質(zhì)粒送至上海華津生物公司進(jìn)行序列測(cè)定，并以DNAStar軟件進(jìn)行同源性分析。

1.2.1.2 鴨疫里默氏桿菌GroEL的表達(dá)和純化 將重組表達(dá)載體pET28a-groEL轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌BL21（DE3），37℃振蕩培養(yǎng)至OD600≈0.5，隨后加入1 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，37℃振搖表達(dá)6 h，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。收集菌體后超聲處理，離心分離上清和包涵體，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白GroEL的表達(dá)情況?？扇苄员磉_(dá)的His-GroEL用His-Binding-Resin親和柱進(jìn)行純化，純化后用BCA法測(cè)定蛋白濃度。

表1 本文中所用的菌株Table 1 Strains used in this study.

1.2.2 鴨疫里默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體細(xì)胞株的制備

1.2.2.1 動(dòng)物免疫 取6～8周齡的BALB/c雌性小鼠，將GroEL重組蛋白與等體積的弗氏完全佐劑進(jìn)行乳化后，按100 μg/只的劑量在小鼠背部和腹部皮下多點(diǎn)注射，進(jìn)行首免；每隔2周用弗氏不完全佐劑加等體積的GroEL重組蛋白乳化后加強(qiáng)免疫，劑量、方法、途徑同首免；經(jīng)3次加強(qiáng)免疫后，從小鼠尾靜脈取血，用間接ELISA法檢測(cè)血清的抗體效價(jià)。選擇血清效價(jià)最高的小鼠，腹腔注射重組蛋白100 μg/只，不添加佐劑，3 d后取脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。

1.2.2.2 單克隆抗體細(xì)胞株的制備及篩選 超免疫后3 d進(jìn)行融合。取免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0混合，離心后棄上清，45 s內(nèi)加入1 mL聚乙二醇，然后逐滴加入10 mL 1640培養(yǎng)基進(jìn)行中止，37℃水浴15 min。用含有飼養(yǎng)細(xì)胞的HAT培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，混勻后以100 μL/孔加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。8～10 d后細(xì)胞集落長(zhǎng)至培養(yǎng)孔1/4時(shí)，完全吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清，用純化GroEL重組蛋白包被的ELISA板（5 μg/mL, 100μL/孔）進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，篩選出陽(yáng)性克隆，同時(shí)加入HT培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆篩選，直至100%陽(yáng)性。

1.2.3 鴨疫里默氏桿菌GroEL單克隆抗體的生物學(xué)特性研究

1.2.3.1 雜交瘤細(xì)胞株的穩(wěn)定性測(cè)定 將雜交瘤細(xì)胞株在相同的操作下連續(xù)傳30代，進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)，測(cè)定其每代細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)；將雜交瘤細(xì)胞株凍存于液氮中，分別在3個(gè)月、6個(gè)月和12個(gè)月后取出凍存的雜交瘤細(xì)胞株復(fù)蘇，擴(kuò)大培養(yǎng)后制備腹水，進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)單抗的腹水效價(jià)。

1.2.3.2 Ig類(lèi)及亞類(lèi)測(cè)定 采用小鼠單克隆抗體分型試劑盒SBA ClonotypingTMSystem/HRP測(cè)定獲得的GroEL單克隆抗體Ig亞類(lèi)，操作過(guò)程嚴(yán)格依照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.3.3 單克隆抗體腹水的制備及效價(jià)測(cè)定 取10周齡BALB/c雌性小鼠，腹腔注射液體石蠟0.3 mL/只，10 d后腹腔接種用無(wú)抗生素?zé)o血清的RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋的雜交瘤細(xì)胞，每只5×105/0.2 mL。間隔5 d后，觀察小鼠狀態(tài)，如腹部明顯膨大，即可收集腹水。采用間接ELISA法測(cè)定腹水單抗效價(jià)。

1.2.3.4 單克隆抗體的特異性鑒定 采用免疫印跡法（Western blot）鑒定抗體特異性。以鴨疫里默氏桿菌血清1型菌株CH3、血清2型菌株NJ3、血清10型菌株HXb2全菌蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，200 V，電泳60 min左右，利用Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽進(jìn)行濕轉(zhuǎn)印，轉(zhuǎn)印條件為100 V、90 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上。轉(zhuǎn)印結(jié)束后將NC膜用含有5%的脫脂乳PBS封閉2 h，PBST洗滌3次，每次5 min。將腹水單抗做1∶2000稀釋?zhuān)跤^(guò)夜，PBST洗滌5次，每次5 min。然后再與1∶5000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG室溫孵育2 h，PBST洗滌5次，每次5 min。加DAB底物顯色液進(jìn)行顯色。同時(shí)對(duì)禽致病性大腸桿菌O1（DE47）、O2（DE14）、O18（CE66）和O78（DE48）菌株，沙門(mén)氏菌（CVCC1805、CAU0118）和禽巴氏桿菌（CVCC 493）的全菌蛋白進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3.5 單克隆抗體的純化 使用HiTrap Protein G HP親和層析方法對(duì)單克隆抗體腹水進(jìn)行純化，操作過(guò)程嚴(yán)格依照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

2 結(jié)果

2.1 鴨疫里默氏桿菌GroEL原核表達(dá)及純化利用引物從鴨疫里默氏桿菌WJ4菌株中擴(kuò)增出1條1629左右的片段，將片段與空載體pET-28a(+)連接轉(zhuǎn)化后，PCR鑒定獲得了5株陽(yáng)性克隆。重組質(zhì)粒序列測(cè)定結(jié)果表明所獲得的陽(yáng)性克隆與目的序列同源性達(dá)到100%。將重組質(zhì)粒pET28a-GroEL轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果表明，重組His-GroEL蛋白在pET-28a(+)載體中成功表達(dá)，在60 kDa左右出現(xiàn)目的條帶。菌體經(jīng)超聲處理后的結(jié)果表明，重組蛋白主要存在上清中。融合蛋白帶有His標(biāo)簽，利用親和層析柱進(jìn)行純化后，重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示，純化蛋白顯示清晰的目的蛋白條帶，表明純化效果較好（圖1）。BCA法測(cè)定純化重組蛋白的濃度為1.4 mg/mL。

2.2 鴨疫里默氏桿菌GroEL蛋白單克隆抗體細(xì)胞株的制備經(jīng)3次免疫后，從小鼠尾靜脈取血，用間接ELISA法檢測(cè)血清的抗體效價(jià)，結(jié)果表明小鼠血清效價(jià)達(dá)到1∶12 800。對(duì)該小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，3 d后取其脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。經(jīng)過(guò)3次亞克隆篩選，最終獲得2株穩(wěn)定分泌鴨疫里默氏桿菌GroEL單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1G2B6、1G2F10。

2.3 鴨疫里默氏桿菌GroEL單克隆抗體的生物學(xué)特性研究

2.3.1 雜交瘤細(xì)胞株的穩(wěn)定性測(cè)定 雜交瘤細(xì)胞株1G2B6、1G2F10經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代和反復(fù)凍融后，測(cè)定其單克隆抗體效價(jià)，ELISA結(jié)果表明其效價(jià)基本一致，表明2株雜交瘤細(xì)胞株穩(wěn)定性良好。

2.3.2 Ig類(lèi)及亞類(lèi)測(cè)定 采用小鼠單克隆抗體分型試劑盒測(cè)定獲得的GroEL單克隆抗體Ig亞類(lèi)，結(jié)果表明細(xì)胞株1G2B6、1G2F10均為IgG1。

2.3.3 單克隆抗體腹水的效價(jià)測(cè)定 按照常規(guī)方法收集單克隆抗體腹水，間接ELISA法測(cè)定腹水單抗效價(jià)，結(jié)果表明雜交瘤細(xì)胞株1G2B6、1G2F10的腹水效價(jià)達(dá)到1∶102 400（圖2）。

圖1 鴨疫里默氏桿菌GroEL蛋白的原核表達(dá)及純化Fig.1 Expression and purif cation of Riemerella anatipestifer GroEL

圖2 GroEL單克隆抗體腹水的ELISA效價(jià)Fig.2 The ELISA titer of the monoclonal antibody in the ascite

2.3.4 單克隆抗體的特異性鑒定 采用Western blot方法鑒定單抗的特異性。結(jié)果表明，單克隆抗體1G2B6、1G2F10均與鴨疫里默氏桿菌血清1型菌株CH3、2型菌株NJ3、10型菌株HXb2發(fā)生特異性結(jié)合，在60 kDa左右出現(xiàn)目的條帶；兩株單抗與禽致病性大腸桿菌O1菌株DE47、O2菌株DE14、O18菌株CE66和O78菌株DE48，沙門(mén)氏菌菌株CVCC1805、CAU0118和禽巴氏桿菌菌株CVCC493均無(wú)反應(yīng)性（圖3、4）。說(shuō)明單克隆抗體1G2B6，1G2F10特異性良好。

2.3.5 單克隆抗體的純化 使用親和層析方法對(duì)單克隆抗體腹水進(jìn)行純化，SDS-PAGE結(jié)果表明純化效果良好，得到了純度高的單克隆抗體（圖5）。

圖3 Western blot鑒定GroEL單克隆抗體1G2B6特異性Fig. 3 Western blot analysis of the specif city of MAb 1G2B6

圖4 Western blot鑒定GroEL單克隆抗體1G2F10特異性Fig. 4 Western blot analysis of the specif city of MAb 1G2F10

圖5 GroEL單克隆抗體的純化Fig. 5 Purif cation of the anti-GroEL monoclonal antibody

3 討論

制備單克隆抗體的關(guān)鍵因素是獲得純度和活性高的免疫原。本研究選擇pET-28a(+)表達(dá)載體進(jìn)行重組蛋白表達(dá)，因其His標(biāo)簽小，并且在上清中獲得大量表達(dá)，從而保證了重組蛋白的純度與活性，為制備特異性強(qiáng)的單克隆抗體提供了良好的免疫原。本研究獲得了2株效價(jià)高、特異性強(qiáng)的GroEL單克隆抗體，2株單抗對(duì)血清1、2和10型的菌株均具有交叉反應(yīng)性，表明該蛋白是一種與不同血清型鴨疫里默氏桿菌具有交叉反應(yīng)性的免疫原性蛋白，與我們先前報(bào)道的結(jié)果一致[9]。

GroEL是分子伴侶家族HSP60成員之一，在新生蛋白質(zhì)的正確折疊和組裝以及變性蛋白質(zhì)的恢復(fù)過(guò)程中起重要作用。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，HSP能引起體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，因此這些分子具有發(fā)展成新生代預(yù)防和治療型疫苗的潛力[10-12]。近期的研究進(jìn)展表明，GroEL是很重要的免疫保護(hù)性蛋白，利用莢膜組織胞漿菌重組的Hsp60免疫小鼠，可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生對(duì)肺部組織胞漿菌病的免疫保護(hù)力[13]。幽門(mén)螺旋桿菌重組GroES-GroEL免疫小鼠后，可保護(hù)小鼠免于胃十二指腸疾病的感染[14]。Chitradevi等[15]首次證明了傷寒傷門(mén)氏菌重組的GroEL對(duì)各種細(xì)菌病原體的交叉保護(hù)效力。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究亦已證明鴨疫里默氏桿菌重組GroEL可誘導(dǎo)雛鴨產(chǎn)生對(duì)該菌不同血清型的交叉免疫保護(hù)力，保護(hù)率可達(dá)37.5%～50%[9]。

鴨疫里默氏桿菌血清型復(fù)雜，迄今為止，已公認(rèn)的有21個(gè)血清型（l～21型）[16]，各血清型之間缺乏有效的交叉保護(hù)，這使得對(duì)該病的免疫預(yù)防困難極大。本研究獲得的2株單克隆抗體，抗體效價(jià)高、特異性強(qiáng)，并且對(duì)血清1、2和10型菌株具有交叉反應(yīng)性，因此可用于研制鴨疫里默氏桿菌的檢測(cè)試劑盒。該單抗的成功研制亦為GroEL蛋白生物學(xué)活性的研究奠定了基礎(chǔ)。

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GENERATION OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO GROEL OF RIEMERELLA ANATIPESTIFER

HOU Wan-wan1,2, HAN Xian-gan2, WANG Shao-hui2, WANG Xiao-lan2, YUE Jia-pin2, CAO Shou-lin2, FAN Hong-jie1, YU Sheng-qing2
(1.Key Laboratory Animal Disease Diagnostic and Immunology, Colledge of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2.Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The objective of this study was to generate monoclonal antibodies (MAbs) against GroEL protein ofRiemerella anatipestifer. The GroEL gene was cloned fromR. anatipestiferstrain WJ4 and the recombinant GroEL was expressed inE. coli. After purif cation, the recombinant GroEL was used to immunize BALB/c mice 3 times. Spleen cells of immunized mice were fused with murine myeloma SP2/O cells. Specif c MAb secreting hybridomas were screened using indirect ELISA and positive hybridomas were cloned 3 times. As a result, two hybridoma cell lines (1G2B6, 1G2F10) stably producing anti-GroEL MAbs were identif ed and established. The isotype of both MAbs was IgG1. The ELISA titer of ascetic f uids was determined to be 1:102 400. In Western blot, both MAbs reacted withR. anatipestiferserotypes 1, 2 and 10 strains but not withEscherichia coli,Salmonella entericaandPasteurella multocidastrains. Besides, both MAbs were specif c forR. anatipestiferserotypes 1, 2 and 10 strains tested. The availability of MAbs specif c for GroEL paved a path for further development of diagnostic kit forR. anatipestifer.

S852.612

A

1674-6422（2014）02-0058-07

2014-03-07

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（201003012）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31272591）

侯灣灣，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)

于圣青，E-mail∶ yus@shvri.ac.cn