賈永宏，朱慶超，楊海濤，武致存，高 璞，李 梅，胡建宏*

(1.陜西省家畜改良站，陜西 涇陽 713702；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.陜西省白水縣家畜改良站，陜西 白水 715600；4.陜西省白水縣動物疫病控制預(yù)防中心，陜西 白水 715600)

牛精液冷凍保護(hù)劑研究進(jìn)展

賈永宏1，朱慶超2，楊海濤1，武致存3，高 璞4，李 梅3，胡建宏2*

(1.陜西省家畜改良站，陜西 涇陽 713702；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.陜西省白水縣家畜改良站，陜西 白水 715600；4.陜西省白水縣動物疫病控制預(yù)防中心，陜西 白水 715600)

牛的人工授精技術(shù)是目前應(yīng)用最為廣泛的動物繁殖技術(shù)之一，對牛的遺傳改良做出了巨大貢獻(xiàn)。但是，在冷凍-解凍過程中仍然有大約40%～50%的精子失去活性，限制良種公牛種用性能的發(fā)揮。論文在分析精子冷凍保存原理的基礎(chǔ)上，闡述了滲透性、非滲透性冷凍保護(hù)劑以及低密度脂蛋白對牛精子的冷凍保護(hù)作用，以期為開發(fā)新型冷凍保護(hù)劑的研究提供一定參考，進(jìn)一步提升牛冷凍精液的質(zhì)量。

牛；精液冷凍保護(hù)劑；冷凍保存原理

1951年，世界上第一頭通過冷凍精液進(jìn)行人工授精牛犢的誕生，開創(chuàng)了牛精液冷凍技術(shù)在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用的先河[1]。我國于1958 年首次進(jìn)行精液冷凍技術(shù)研究，并取得成功[2]。20世紀(jì) 80年代，我國開始從國外引進(jìn)先進(jìn)的設(shè)備和技術(shù)用于冷凍精液的生產(chǎn)，到90年代時冷凍精液逐步由顆粒型轉(zhuǎn)向細(xì)管型[3]。目前利用冷凍精液人工授精技術(shù)在奶牛繁殖與改良方面應(yīng)用最為普及，幾乎達(dá)到100%[4]。雖然如此，但精液冷凍-解凍后仍有大約50%的精子失去活性，嚴(yán)重降低了良種公牛的利用率。本文闡述了關(guān)于牛精液冷凍的基本原理以及冷凍保護(hù)劑的研究進(jìn)展，以期為進(jìn)一步提升牛冷凍精液質(zhì)量提供參考。

1 精子冷凍保存的原理

精子是一種生殖細(xì)胞，當(dāng)外界環(huán)境溫度發(fā)生變化時，精子本身的活動力和代謝能力也會發(fā)生變化。將采集的新鮮精液經(jīng)過品質(zhì)檢查后，利用液態(tài)氮(-196 ℃)或固態(tài)二氧化碳(干冰-79 ℃)等作為冷源，將精子保存在超低溫環(huán)境下，精子的代謝活動幾乎完全受到抑制并可長期保存，也就是精子的生命在靜止?fàn)顟B(tài)下長時間保存。當(dāng)溫度回升解凍后，精子又能恢復(fù)原有活力，并且具有受精的能力。目前，關(guān)于細(xì)胞冷凍保存的機(jī)理尚不完全清楚，代表性的假說主要有以下五種。

1.1 細(xì)胞冷凍損傷的兩因素假說

1972年，Mazur[5]對倉鼠組織細(xì)胞進(jìn)行了低溫保存研究，并提出了細(xì)胞冷凍損傷的兩因素假說，認(rèn)為造成細(xì)胞冷凍損傷的獨立因素有兩個：一是過快冷卻導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，冰晶通過破壞精子細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)以及滲透壓升高，從而對細(xì)胞造成損害。冷卻速度越快，所造成的損傷越大；二是過慢冷卻導(dǎo)致的溶質(zhì)損傷/溶液損傷，這是由于細(xì)胞過長時間暴露在高濃度溶液中所致。在高濃度溶液中，細(xì)胞脫水收縮，引起細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)濃度升高，細(xì)胞器也隨之發(fā)生變化，并且在滲透收縮過程中，細(xì)胞膜壓力的增加也導(dǎo)致了細(xì)胞損傷。一般冷卻速度越慢時，該損傷就越大。當(dāng)然，兩因素理論中的過快冷卻、過慢冷卻是相對具體細(xì)胞而言。

對于冷凍保存來說，在臨界溫度范圍內(nèi)的冷卻/凍結(jié)速率(5～50 ℃/h)相當(dāng)重要，決定精子能否與細(xì)胞外環(huán)境保持平衡或隨胞內(nèi)冰晶形成可能性的逐步增加變成過冷狀態(tài)。在緩慢冷卻過程中，精子會一直脫水直至達(dá)到在細(xì)胞內(nèi)外的滲透平衡點，即細(xì)胞脫水會最大化。而過多地提高冷卻速率，脫水不足會導(dǎo)致胞內(nèi)冰晶成核。然而，如果冷卻速度在所需值(50～100 ℃/h)，即可以減少過度的細(xì)胞內(nèi)脫水，降低過度的細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度和減少細(xì)胞皺縮[5-6]。

1.2 電解質(zhì)失衡假說

20世紀(jì)50年代，Lovelock等[7]研究認(rèn)為，動物精子對電解質(zhì)溶液的濃度具有一定的耐受范圍，而一旦超過該范圍時就會損傷精子，甚至導(dǎo)致精子的死亡。當(dāng)環(huán)境溫度降低時，細(xì)胞間隙中的水分會形成細(xì)小冰晶，由于細(xì)胞脫水，細(xì)胞間隙液體所含的電解質(zhì)的濃度相應(yīng)升高，滲透壓增大，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)水分外滲，細(xì)胞脫水皺縮。隨著環(huán)境溫度的繼續(xù)降低，胞內(nèi)剩余水分結(jié)冰，致使胞內(nèi)的電解質(zhì)的濃度也快速升高，當(dāng)超過細(xì)胞的耐受力范圍濃度時，就會對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，包括酶活動紊亂、細(xì)胞器受損、蛋白質(zhì)變性、pH改變等，細(xì)胞最終死亡。該假說與Mazur提出的兩因素假說--過慢冷卻導(dǎo)致溶質(zhì)損傷的理論有些近似。當(dāng)對精子進(jìn)行低溫保存時，在稀釋液內(nèi)加入水溶性、通透性且對細(xì)胞無毒害作用的中性物質(zhì)時，可以抑制冷凍過程中冰晶的形成，從而減輕冷凍保存過程對精子所造成的損害。

1.3 物理屏障假說

物理屏障假說認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)水分子會形成物理屏障保護(hù)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)免受傷害，但是冷凍會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脫水，蛋白質(zhì)由于失去水分子的保護(hù)而使其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，細(xì)胞受到低溫?fù)p傷。1962年，研究者提出了硫氫基假說，認(rèn)為由于溫度的降低導(dǎo)致細(xì)胞膜的物理屏障發(fā)生變化，從而引起了細(xì)胞的低溫?fù)p傷[8]。細(xì)胞的抗凍能力取決于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)硫氫基(-SH)的含量，但在冷凍條件下，蛋白質(zhì)會發(fā)生脫水并相互靠攏，當(dāng)靠攏到一定程度時，-SH基會發(fā)生氧化作用，生成-SS-鍵或-S-S-鍵，導(dǎo)致膜蛋白分子構(gòu)象發(fā)生改變而凝聚。解凍后，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)重新吸收水分，肽鏈松散，氫鍵斷裂，但由于雙硫鍵保持不變，導(dǎo)致細(xì)胞蛋白質(zhì)的空間構(gòu)型難以復(fù)原。同時，由于細(xì)胞內(nèi)聚力比膜蛋白小，在細(xì)胞結(jié)冰時產(chǎn)生張力，雙分子的脂類層因冷凍而較易發(fā)生破裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜的選擇透過性發(fā)生改變，胞內(nèi)物質(zhì)外滲，造成細(xì)胞死亡。

1.4 結(jié)構(gòu)水假說

1965年，Karrow等[9]提出結(jié)構(gòu)水假說，認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)的水由自由水和束縛水兩種類型所組成，束縛水是那些與蛋白質(zhì)發(fā)生水合作用后包圍在蛋白質(zhì)表面且不易自由流動的水分，對于維持細(xì)胞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能具有重要作用。在細(xì)胞冷凍時，胞內(nèi)的自由水首先凍結(jié)成冰，隨著冷凍的持續(xù)進(jìn)行，導(dǎo)致胞內(nèi)自由水比例降低，胞內(nèi)的束縛水開始析出且凍結(jié)成冰，導(dǎo)致包圍在蛋白質(zhì)表面的束縛水減少甚至消失，失去束縛水保護(hù)的蛋白質(zhì)因析出凝聚而發(fā)生變性，造成細(xì)胞損傷甚至死亡。

1.5 生物膜傷害假說

該假說由鄭斯涌[8]提出，他認(rèn)為造成細(xì)胞冷凍損傷的因素主要有兩個：(1)冷凍-解凍過程中，細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間的結(jié)冰與融化對細(xì)胞造成了損傷；(2)低溫冷凍時冷凍保護(hù)劑對細(xì)胞的毒害作用。在這兩個因素的作用下，導(dǎo)致細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，尤其是對細(xì)胞膜、核膜、線粒體膜等生物膜的損害很大，導(dǎo)致膜蛋白發(fā)生變性，膜的通透性改變，穩(wěn)定性下降；線粒體膜遭受破壞，影響能量的產(chǎn)生。生物膜的損傷使得細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的合成能力和酶活性顯著降低。當(dāng)冷凍結(jié)束后，大量水分會滲入細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外充水，形成缺氧微環(huán)境，最終導(dǎo)致細(xì)胞的各種功能下降，細(xì)胞死亡。

2 精液冷凍保護(hù)劑

冷凍保護(hù)劑根據(jù)其保護(hù)原理可分為非滲透性和滲透性兩大類。非滲透性保護(hù)劑難以滲透到精子細(xì)胞內(nèi)部，但可以結(jié)合溶液中的水分子，使溶液中的自由水含量降低。同時使細(xì)胞外溶液的濃度增高，細(xì)胞內(nèi)水分滲出，細(xì)胞內(nèi)溶液的濃度也升高，從而減少細(xì)胞內(nèi)外冰晶的形成，從而保護(hù)細(xì)胞免遭損傷的一類保護(hù)劑。如：葡萄糖、蔗糖、聚乙二醇、白蛋白等[10]。滲透性保護(hù)劑可以滲透到細(xì)胞內(nèi)部，使細(xì)胞內(nèi)外溶液的濃度升高，胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度降低，保護(hù)精子細(xì)胞避免高濃度電解質(zhì)的損害。另外，細(xì)胞內(nèi)的水分也不過渡向外滲出，從而避免細(xì)胞因過分脫水而皺縮。例如甘油、二甲基亞砜、甲醇、酰胺類、乙二醇等[10]。

2.1 滲透性冷凍保護(hù)劑對精子的保護(hù)作用

二甲基亞砜 (DMSO) 和甘油是目前比較常用的抗凍保護(hù)劑，但多數(shù)報道認(rèn)為甘油的保護(hù)效果更好，所以甘油的應(yīng)用更為廣泛[11]。甘油是一個擁有多個羥基、氫鍵具有結(jié)合水的能力的滲透性保護(hù)劑，能夠滲透生物膜。在精子冷凍保存過程中，甘油發(fā)生作用是通過替代細(xì)胞內(nèi)的水分來維持細(xì)胞體積、離子間的交互作用和降低水的冰點，以及隨后的降低電解質(zhì)濃度[12-13]。DMSO是一種快速滲透性的冷凍保護(hù)劑，比甘油的分子量低，但滲透性比甘油要高，且DMSO可以抑制羥基自由基的不良影響。但是，DMSO本身具有一定的毒性，有時會對細(xì)胞產(chǎn)生致死效應(yīng)，這種效應(yīng)大部分歸因于它的毒性而非滲透性。

2.2 非滲透性保護(hù)劑對牛精子的保護(hù)作用

精液病菌的感染與疾病的傳播可能由動物類冷凍保護(hù)劑引起，因而科學(xué)家近年來一直在不斷尋找新的冷凍保護(hù)劑，以提高其保護(hù)效果并減少疾病的傳播。Woelders等[6]報道，海藻糖和蔗糖均可在冷凍環(huán)境下保護(hù)精子免受傷害，但蔗糖的保護(hù)效果更明顯；王鋒等[14]通過在稀釋液中添加乙二醇或丙二醇，使精子的頂體完整率得到顯著提高，但精子活力與存活時間無明顯變化；Bilodeau等[15]研究表明，在EYTG中添加各種硫醇，可以有效抑制EYTG對精子的毒害作用；張文舉等[16]報道，還原型谷胱甘肽可以顯著提高精子活力和頂體完整率，改善母牛情期受胎率；Hu等[17]研究表明，稀釋液中添加維生素E可以降低脂質(zhì)的過氧化作用，提高冷凍-解凍后的牛精液品質(zhì)；Fabbrocini等[18]及Bilodeau等[19]報道，在精液稀釋液中加入丙酮酸鹽可以提高抗氧化性能，改善地中海水牛精子的凍后質(zhì)量。Bucak等[20]研究認(rèn)為，抗氧化劑(蛋氨酸、肌醇和肉堿)可以保護(hù)精子DNA免受冷凍傷害，維持其完整性；Verberckmoes等[21]認(rèn)為，附睪液對于提高精子活力有很大幫助。Tuncer等[22]研究認(rèn)為，半胱氨酸和谷胱甘肽也能夠降低冷凍對DNA的損害；Ansari等[23]在稀釋液中添加丁羥甲苯，發(fā)現(xiàn)能夠顯著提高牛精子的凍后質(zhì)量；Hu等[24-25]研究發(fā)現(xiàn)，稀釋液中添加維生素B12可顯著提高牛精子活力、頂體完整率和質(zhì)膜完整率。另外，稀釋液中添加維生素還可有效減少由冷凍-解凍造成的氧化應(yīng)激，維持精子的運(yùn)動能力[26-27]。

3 低密度脂蛋白對牛精子的保護(hù)作用

低密度脂蛋白(LDL)和磷脂是卵黃中對精子起保護(hù)作用的主要有效成分。卵黃中的固體物質(zhì)由LDL和其它物質(zhì)組成，其中，低密度脂蛋白大約占2/3。LDL是一種甘油三酸脂和膽固醇內(nèi)核被磷脂和蛋白外膜包圍的球狀分子，包含83%～89%的脂質(zhì)和11%～17%的蛋白質(zhì)[28]。Lamia等[29]研究證明，用LDL完全替代蛋黃后，提高了牛精子凍后活力。但是，卵黃中存在一些有害成分，這些成分不利于LDL在超低溫下對牛精子的冷凍保護(hù)。卵黃中的小顆粒物質(zhì)對精子凍后活率產(chǎn)生一定的有害作用[30]，卵黃中的高密度脂蛋白可誘導(dǎo)精子膜上的膽固醇外流，導(dǎo)致精子提前獲能[31]。關(guān)于LDL保護(hù)精子的原理，Bergeron等[32]認(rèn)為，LDL與精清蛋白質(zhì)結(jié)合后可以減少脂質(zhì)含量，還可防止精子質(zhì)膜的內(nèi)部損傷；LDL中的脂質(zhì)能夠與精子膜結(jié)合，防止細(xì)胞膜的完整性受到破壞，從而達(dá)到保護(hù)精子的作用。

雖然牛冷凍精液的研究相對比較成功，但我國牛冷凍精液的研究水平與國外相比仍然存在較大差距。精液冷凍技術(shù)是現(xiàn)代動物繁殖技術(shù)的基礎(chǔ)，對于提高優(yōu)良公牛的利用率，推動牛品種改良步伐，保護(hù)優(yōu)良種牛資源以及大力發(fā)展養(yǎng)牛業(yè)，促進(jìn)中國畜牧業(yè)的發(fā)展等有巨大作用。因此，今后應(yīng)該在冷凍-解凍過程中精子細(xì)胞內(nèi)外蛋白磷酸化水平上繼續(xù)探索，研究低溫信號在精子內(nèi)的傳遞與調(diào)控過程，揭示精子冷凍損傷的分子機(jī)制，進(jìn)一步提高牛冷凍精液的質(zhì)量。

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ResearchProgressinCryoprotectantofBullSemenCryopreservation

JIA Yong-hong1,ZHU Qing-chao2,YANG Hai-tao1,WU Zhi-cun3,GAO Pu3,LI Mei3,HU Jian-hong2*

(1.DomesticAnimalImprovingStation,Jingyang,Shaanxi713702,China;2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,YanglingShaanxi712100,China;3.DomesticAnimalImprovingStationofBaishuiCounty，BaishuiShaanxi715600,China;4.AnimalDiseasesControl&PreventionCentreofBaishuiCounty,BaishuiShaanxi,715600,China)

The artificial insemination for a bull is one of the most widely used reproductive technologies for animals,which contribute greatly to the genetic improvement for cattle.However,about 40% to 50% sperms lose motility during the freezing-thawing process,restricting the breeding performance of fine breed bulls.Based on analyzing the principle of sperm cryopreservation,the article elaborated sperm cryopreservation through permeable and impermeable cryoprotectant and low density lipoprotein,hoping to provide a reference for the research on developing new cryoprotectants so as to improve the quality of frozen semen.

bull;sperm cryoprotectant;cryopreservation principle

2013-12-2

西北農(nóng)林科技大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費科技創(chuàng)新專項重點項目(QN2011061)

賈永宏(1966-)，男，陜西白水人，高級畜牧師，主要從事牛品種遺傳改良和技術(shù)推廣工作。E-mail:laojiatongzhi1988@163.com

*[通訊作者]胡建宏(1969-)，男，陜西白水人，博士，教授，主要從事家畜生殖生理調(diào)控方面的教學(xué)與科研工作。E-mail：hjh19732008@126.com

S811.6

A

1005-5228(2014)01-0005-04