尹磊淼(綜述） 王 宇 徐玉東 魏 穎 王文倩 楊永清(審校）

(上海中醫(yī)藥大學(xué)上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所 上海 200030)

金屬硫蛋白-2（MT-2）表達(dá)調(diào)控和蛋白相互作用研究進(jìn)展

尹磊淼(綜述） 王 宇 徐玉東 魏 穎 王文倩 楊永清△(審校）

(上海中醫(yī)藥大學(xué)上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所 上海 200030)

金屬硫蛋白-2(metallothionein-2,MT-2)作用廣泛,具有多種生物學(xué)功能。本文介紹了MT-2生物學(xué)特性、表達(dá)調(diào)控機(jī)制和蛋白相互作用等研究進(jìn)展,以期對(duì)MT-2蛋白有更全面的認(rèn)識(shí),并基于某一特定疾病進(jìn)行系統(tǒng)性研究。

金屬硫蛋白-2(MT-2)； 表達(dá)調(diào)控；蛋白相互作用

金屬硫蛋白(metallothionein,MT)最早由Margoshes和Vallee博士［1］于1957年研究金屬生物學(xué)作用時(shí)被發(fā)現(xiàn),因其含有豐富巰基且能螯合大量金屬離子,故被稱(chēng)為金屬硫蛋白。經(jīng)金屬硫蛋白命名委員會(huì)統(tǒng)計(jì)的20個(gè)成員雖然普遍分子量較低,僅含有60～63個(gè)氨基酸,但半胱氨酸含量占23%～33%,且均呈保守性分布［2］。金屬硫蛋白多肽鏈不含芳香族氨基酸,但每個(gè)蛋白分子可通過(guò)半胱氨酸巰基結(jié)合7～12個(gè)金屬離子,從而具有特殊的金屬巰基化合物光譜特性［3］。哺乳動(dòng)物金屬硫蛋白可分為4個(gè)亞型［4］,其中MT-1和MT-2在肺臟、大腦等全身組織和器官中表達(dá),并且肝臟和腎臟中表達(dá)水平最高,MT-3僅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和男性生殖系統(tǒng)表達(dá),MT-4僅在層狀上皮細(xì)胞表達(dá)［5-6］。

MT-2是金屬硫蛋白家族中的重要成員之一,主要生理特性表現(xiàn)為金屬離子結(jié)合性和還原性,能與鋅、銅、鐵、鎘等二價(jià)離子可逆性結(jié)合以維持體內(nèi)金屬離子平衡［3］,也可通過(guò)巰基(-SH)與機(jī)體氧自由基結(jié)合,具有較強(qiáng)的還原性［7］。MT-2還參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化等生物學(xué)過(guò)程,并和癌癥、呼吸及神經(jīng)系統(tǒng)等疾病密切相關(guān)［8-9］。本文對(duì)MT-2的生物學(xué)特性、表達(dá)調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)效應(yīng)及其與某些重大疾病的關(guān)系進(jìn)行綜述。

MT-2蛋白分子生物學(xué)特性

結(jié)合二價(jià)金屬離子 人類(lèi)MT-2蛋白相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為6×103,但蛋白SDS-PAGE電泳條帶位置特殊,出現(xiàn)在相對(duì)分子質(zhì)量為(12～15)×103區(qū)域。等電點(diǎn)為p H4.0,基因染色體定位于第16號(hào)染色體長(zhǎng)臂13區(qū),編碼61個(gè)氨基酸,其中20個(gè)為半胱氨酸［6］。金屬離子與半胱氨酸相結(jié)合形成四面體,存在于MT-2蛋白呈啞鈴狀空間結(jié)構(gòu)的α和β兩個(gè)獨(dú)立功能域中［10］。MT-2蛋白結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖1。

結(jié)合的金屬離子在特定條件下可以解離以獲得還原狀態(tài)下Apo-MT-2。Liang等［11］將30μmol/L MT-2重組蛋白加入到含10 mmol/L二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)的緩沖液中(10mmol/L Tris-Hcl,100 mmol/L KCl,p H=7.4),4℃孵育3 h,透析后即可去除結(jié)合的二價(jià)金屬離子和DTT。Koh等［12］將2.4 mg MT-2蛋白在0.5 mol/L HCl中孵育3 min脫去金屬離子,再通過(guò)分子篩層析回收Apo-MT-2。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)利用DTNB法檢測(cè)MT-2蛋白結(jié)合不同金屬離子親和度高低依次為：銅離子＞鉻離子＞鋅離子,而抗氧化性能強(qiáng)弱依次為：Apo-MT-2＞Zn-MT-2＞Cd-MT-2＞Cu-MT-2［11］。在氧化劑存在條件下,MT-2巰基和二價(jià)離子親和性降低［1］。

參與氧化應(yīng)激 MT-2蛋白多肽鏈半胱氨酸除了能與金屬離子結(jié)合外,也是蛋白還原性的活性位點(diǎn),能與機(jī)體氧自由基反應(yīng),清除游離活性氧,減輕細(xì)胞氧化損傷,并廣泛參與體內(nèi)氧化還原反應(yīng)［7］。其分子機(jī)制主要包括促自由基形成化合物能顯著增強(qiáng)MT-2表達(dá),MT-2蛋白對(duì)自由基的清除及細(xì)胞抗氧化保護(hù)作用等。Bauman等［13］研究發(fā)現(xiàn)給予小鼠皮下注射0.1～0.5 mmol/kg百草枯(Paraquat)能使肝臟MT-2蛋白表達(dá)增強(qiáng)36倍。注射氮基三醋酸鐵可使肝MT-2蛋白表達(dá)在4 h內(nèi)提高2.5倍,腎MT-2蛋白提高4倍［14］。表達(dá)增高的MT-2蛋白可直接清除自由基等活性基團(tuán),對(duì)肝、腎等細(xì)胞產(chǎn)生良好保護(hù)作用。Wang等［15］研究發(fā)現(xiàn)MT-2蛋白可有效抑制雙氧水對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化作用。腹腔注射2.5 mg/kg MT蛋白可通過(guò)促進(jìn)胞內(nèi)雙氧水分解,有效保護(hù)鉈元素對(duì)大鼠肝臟的氧化應(yīng)激損傷［16］。MT-2還可抑制DNA氧化損傷產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-OHDG)的產(chǎn)生,保護(hù)細(xì)胞DNA不受破壞［17］。

MT-2蛋白誘導(dǎo)表達(dá)機(jī)制MT-2表達(dá)受到多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)。Heuchel等［18］發(fā)現(xiàn)鋅、鎘等金屬離子刺激機(jī)體表達(dá)MT主要通過(guò)激活金屬反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子1(metal-responsive transcription factor-1, MTF-1)實(shí)現(xiàn)。利用小鼠MTF-1基因敲除細(xì)胞,Bi等［19］研究發(fā)現(xiàn)環(huán)己酰亞胺可通過(guò)作用MTF-1使MT表達(dá)增加5倍以上,且呈現(xiàn)明顯時(shí)效和量效關(guān)系。Kelly等［20］研究認(rèn)為位于MT-2基因上游1kb處和MT-1基因上游7kb處的兩個(gè)糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件可分別調(diào)控MT-1/2表達(dá)。鋅指蛋白PZ120包含POZ結(jié)構(gòu)域,可與DNA序列結(jié)合參與基因表達(dá)調(diào)控,其多肽鏈被發(fā)現(xiàn)可特異性結(jié)合MT-2 DNA轉(zhuǎn)錄起始區(qū)序列,從而抑制啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活［21］。鋅指蛋白Sp1參與機(jī)體發(fā)育、細(xì)胞有絲分裂等表達(dá)調(diào)控,能和MT-2競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合鋅等二價(jià)離子［22］,維持Apo-MT-2在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定存在［23］,進(jìn)而調(diào)控p53等下游信號(hào)通路［24］。其他轉(zhuǎn)錄因子如抗氧化反應(yīng)元件(anti-oxidative response element,ARE)［25］,CUP1/2 (Cu-binding protein 1/2)［26］以及ras基因［27］等也被發(fā)現(xiàn)和MT蛋白表達(dá)密切相關(guān)。

環(huán)境中金屬離子是提高機(jī)體MT-2表達(dá)的重要因素。連續(xù)2天(每天1次)腹腔注射10 mg/kg ZnSO4可將大鼠貧化鈾損傷模型腎臟MT-2基因表達(dá)顯著提高2倍,并將死亡高峰時(shí)間平均推遲4天,生存率提高60.03%［28］。分別給予細(xì)胞不同濃度CdSO4、CuCl2和ZnSO4刺激,發(fā)現(xiàn)MT-2 mRNA最強(qiáng)表達(dá)出現(xiàn)在100μmol/L CuCl2處理4 h后［29］。給Caco-2細(xì)胞200μmol/L ZnSO4刺激,12 h后MT蛋白表達(dá)提高了2倍［30］。Kikuchi等［31］研究發(fā)現(xiàn)500μmol/L ZnCl2或50μmol/L CdCl2孵育48 h可以顯著提高M(jìn)T蛋白在人星形細(xì)胞瘤細(xì)胞中表達(dá),且IL-1(100 U/m L)中加入10μmol/L ZnCl2可有效提高其對(duì)MT蛋白誘導(dǎo)的表達(dá)水平。

Ghoshal等［32］發(fā)現(xiàn)感染流感病毒可將小鼠肝臟MT-2表達(dá)提高15～20倍,肺臟MT-2表達(dá)提高8～12倍,該效應(yīng)可由IL-6、IL-10和IL-12等白細(xì)胞介素激活JAK-STAT信號(hào)通路實(shí)現(xiàn),而皮質(zhì)激素受體抑制劑RU-486可拮抗MT-2表達(dá)增高。此外,利用聚丙烯管限制小鼠活動(dòng)12 h可將小鼠肝臟MT-2蛋白表達(dá)提高10～20倍,皮下預(yù)先注射0.5 mg RU-486可降低MT-2表達(dá)至模型組的50%,但兒茶酚胺受體阻滯劑納多洛爾對(duì)其表達(dá)無(wú)影響［33］。

MT-2蛋白相互作用分子MT-2蛋白除了離子結(jié)合性和還原性,還可以通過(guò)配體受體相互作用傳遞信號(hào),從而介導(dǎo)更廣泛的生物學(xué)作用。MT蛋白發(fā)現(xiàn)者之一Vallee實(shí)驗(yàn)室曾發(fā)現(xiàn)ATP可與MT蛋白1∶1結(jié)合,參與鋅離子解離和蛋白巰基二硫鍵形成等生物學(xué)過(guò)程［34］。雖然Zangger等［35］對(duì)該發(fā)現(xiàn)提出過(guò)質(zhì)疑,但人們一直沒(méi)有停止對(duì)MT結(jié)合蛋白的探索。

Klassen等［36］利用表面等離子共振技術(shù)發(fā)現(xiàn)腎遠(yuǎn)端小管細(xì)胞表面megalin受體可以和MT蛋白結(jié)合并介導(dǎo)對(duì)蛋白內(nèi)吞攝取,MT多肽鏈序列SCKKSCC是上述反應(yīng)關(guān)鍵位點(diǎn)。Rao等［37］利用酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)MT-2和蛋白激酶C家族PKCmu相互作用,參與前列腺癌細(xì)胞增殖和化學(xué)耐藥性。Gon?alves等［38］利用酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)MT-2蛋白和轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白存在相互作用關(guān)系,并利用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定、免疫共沉淀、交叉耦合和免疫印跡等多種技術(shù)證明這可能是阿爾茨海默病潛在的治療靶點(diǎn)。Cui等［39］同樣利用酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)食管癌相關(guān)基因2和MT-2相互作用,并利用GST pull down技術(shù)和免疫共沉淀技術(shù)加以確認(rèn)。在乳腺癌上皮細(xì)胞中,野生型和突變無(wú)活性P53蛋白均能和MT蛋白相結(jié)合,參與細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過(guò)程［40］。Xia等［41］也利用表面等離子共振技術(shù)證實(shí)P53和Apo-MT存在直接結(jié)合作用。

利用在線(xiàn)生物信息學(xué)基因蛋白相互作用檢索工具STRING(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes and Proteins,http：//string. embl.de),我們對(duì)MT-2潛在的直接或間接相互作用蛋白進(jìn)行搜索和預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)該蛋白可能和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9,MMP9),褪黑素受體1B(melatonin receptor 1B,MTNR1B)和G蛋白偶聯(lián)受體50(G protein-coupled receptor 50,GPR50)等存在相互作用關(guān)系(圖2),這為進(jìn)一步研究MT-2蛋白機(jī)制提供了新的線(xiàn)索。

MT-2蛋白參與癌癥、呼吸系統(tǒng)疾病等多種重大疾患MT-2蛋白是多種癌癥標(biāo)記物并參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和調(diào)控［9］。Goulding等［42］分析100例原發(fā)性乳腺癌患者病理資料發(fā)現(xiàn)MT蛋白高表達(dá)和乳腺癌腫瘤類(lèi)型、復(fù)發(fā)以及預(yù)后等密切相關(guān)。Martano等［43］利用免疫組化技術(shù)發(fā)現(xiàn)MT表達(dá)和分泌腺腫瘤發(fā)病密切相關(guān),可能是潛在診斷標(biāo)記物。MT-2蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)顯著性增強(qiáng),結(jié)合Ki-67和微小染色體支持蛋白2(minichromosome maintenance protein-2,MCM-2)可對(duì)疾病預(yù)后作出判斷［44］。利用MT-1/2基因敲除小鼠模型,Majumder等［45］研究發(fā)現(xiàn)MT蛋白能有效保護(hù)肝損傷并降低肝癌發(fā)生率。

MT-2蛋白參與呼吸系統(tǒng)疾病多種生理病理過(guò)程。Inoue等［46］利用雞卵蛋白致敏野生型和MT基因敲除小鼠,激發(fā)后24 h觀(guān)察發(fā)現(xiàn)肺泡灌洗液中IL-1β、嗜酸細(xì)胞活化趨化因子等表達(dá)顯著增強(qiáng)。Takano等［47］認(rèn)為MT基因敲除小鼠比野生型小鼠更容易發(fā)生肺部炎癥和肺水腫。在鎳誘導(dǎo)肺損傷模型中,MT轉(zhuǎn)基因小鼠平均生存時(shí)間為124.8 h,明顯高于對(duì)照組103.4 h和MT基因敲除組84.8 h,基因表達(dá)譜研究發(fā)現(xiàn)潛在機(jī)制涉及炎癥控制、纖維化和肺表面活性物質(zhì)平衡等生物學(xué)過(guò)程［48］。

小結(jié)MT-2作用廣泛,涉及多種生物學(xué)過(guò)程并參與機(jī)體多種重大疾病的發(fā)生,在今后的研究中需要在效應(yīng)機(jī)制和臨床應(yīng)用中給予更多關(guān)注。應(yīng)整合生物信息學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等方法和技術(shù),進(jìn)一步研究其蛋白功能、表達(dá)調(diào)控和相互作用機(jī)制,以期對(duì)MT-2蛋白有更全面認(rèn)識(shí),并基于某一特定疾病進(jìn)行系統(tǒng)性研究。

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The research progress of gene expression regulation and protein-protein interaction of metallothionein-2（MT-2）

YIN Lei-miao,WANG Yu,XU Yu-dong,WEI Ying,WANG Wen-qian,YANG Yong-qing△
(Shanghai Research Institute of Acupuncture and Meridian,Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200030,China)

Metallothionein-2(MT-2)is a protein with a variety of biological functions.This article describes the biological characteristics,expression regulation mechanisms and protein interaction studies of MT-2,which lays a solid foundation for further comprehensive study of the protein in a particular disease.

metallothionein-2(MT-2)； expression regulation； protein-protein interaction

Q 51

B

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.01.022

2012-11-30；編輯：張秀峰)

國(guó)家自然科學(xué)基金(81001548,8117334,81173332,81202753)；上海市青年科技啟明星計(jì)劃(12QA1403000)；上海市教委和上海市教育發(fā)展基金會(huì)“晨光計(jì)劃”資助項(xiàng)目(10CG45)；上海市衛(wèi)生系統(tǒng)優(yōu)秀青年人才培養(yǎng)計(jì)劃(XYQ2013081)

△Corresponding author E-mail：dryqyang@163.com

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(81001548,8117334,81173332,81202753)；Shanghai Rising-Star program(12QA1403000)；“Chen Guang”project supported by Shanghai Municipal Education Commission and Shanghai Education Development Foundation(10CG45),and Science Foundation for the Excellent Youth Scholars of Shanghai Health System(13Y065).