竇 婷，歐陽慧子，王興蕊，薄 芳，何 俊

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

·中藥研究·

HPLC-MS/MS法測(cè)定大鼠血漿中麻黃堿、偽麻黃堿濃度及藥動(dòng)學(xué)研究*

竇 婷1，歐陽慧子2，王興蕊1，薄 芳1，何 俊1

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

[目的]建立同時(shí)檢測(cè)大鼠血漿中麻黃堿、偽麻黃堿的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS/MS），并對(duì)大鼠口服三拗湯后的麻黃堿、偽麻黃堿進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究。[方法]血漿樣品經(jīng)堿化和乙酸乙酯液-液萃取，以鹽酸苯丙醇胺為內(nèi)標(biāo)，乙腈-0.1%甲酸水（4∶96）為流動(dòng)相，經(jīng)Agilent Zorbax SB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）分離，采用電噴霧離子源（ESI），以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式進(jìn)行正離子檢測(cè)，定量分析的離子反應(yīng)分別為：m/z 166.2→m/z 148.2（麻黃堿），m/z 166.2→m/z 148.2（偽麻黃堿）和m/z 152.1→m/z 134.1（鹽酸苯丙醇胺）。[結(jié)果]麻黃堿和偽麻黃堿血藥濃度在20～10 000 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，批內(nèi)、批間精密度RSD均小于5.3%，高、中、低3種濃度平均方法回收率大于64.7%。[結(jié)論]該方法專屬、快速、靈敏，可用于麻黃堿、偽麻黃堿的藥代動(dòng)力學(xué)研究。

麻黃堿；偽麻黃堿；藥代動(dòng)力學(xué)；三拗湯；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

三拗湯出自《太平惠民和劑局方》，由麻黃、杏仁和甘草3味藥物組方，臨床用于感冒風(fēng)寒、咳嗽氣喘[1-2]、痰多胸悶、頭痛鼻塞等證。方中以麻黃為君，具有解表宣肺散寒的作用[3-5]。麻黃的成分主要含多種生物堿和少量揮發(fā)油，其中生物堿類以麻黃堿與偽麻黃堿為主。近年來關(guān)于麻黃堿與偽麻黃堿的含量測(cè)定方法多為毛細(xì)管電泳法[6-10]、高效液相色譜法[11-15]、氣相色譜法和氣-質(zhì)聯(lián)用方法[16-18]。毛細(xì)管電泳法穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較差[19]；高效液相色譜法靈敏度低；氣相色譜法和氣-質(zhì)聯(lián)用方法樣品需要衍生化，較復(fù)雜。本文建立了同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中麻黃堿、偽麻黃堿血藥濃度的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS/MS），并將此方法應(yīng)用于大鼠灌服三拗湯后麻黃堿和偽麻黃堿的藥代動(dòng)力學(xué)研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器 API 3200型串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)AB公司），配備電噴霧離子源；Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），Analyst Software數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國(guó)AB公司），梅特勒-托利多AX 205分析天平（瑞士Mettler Toledo公司），超純水系統(tǒng)（Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑 鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、鹽酸苯丙醇胺均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，乙腈（Fisher Scientific）、甲醇（TEDIA）、甲酸（天津市光復(fù)化工研究所）均為色譜純，碳酸鈉（天津化學(xué)試劑一廠）、乙酸乙酯（天津凱信化學(xué)工業(yè)有限公司）均為分析純，水為Millipore超純水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，雄性，體質(zhì)量200～230 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（合格證編號(hào)0163041）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），保護(hù)柱：Agilent Zorbax C18柱（4.6 mm×12.5 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈－0.1%甲酸水（4∶96），流速：0.4 mL/min，柱溫：25℃。

2.2 質(zhì)譜條件 離子源為ESI源；簾氣Curtain Gas為15 psi；碰撞氣Collision Gas為5 psi；源噴射電壓Ion Spray Voltage為4 500 V；霧化器GS1為40 psi、加熱器GS2為60psi；正離子方式檢測(cè)，掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)；定量分析時(shí)的離子反應(yīng)分別為m/z 166.2→m/z 148.2（麻黃堿），m/z 166.2→m/z 148.2（偽麻黃堿）和m/z 152.1→m/z 134.1（鹽酸苯丙醇胺）。

2.3 溶液的制備

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱取麻黃堿、偽麻黃堿各10 mg分別置于25 mL容量瓶，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得儲(chǔ)備液。量取一定量的麻黃堿、偽麻黃堿儲(chǔ)備液混合，用純水稀釋為10 mg/L的工作液，-20℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱取鹽酸苯丙醇胺標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于25 mL容量瓶，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得儲(chǔ)備液。量取一定量的鹽酸苯丙醇胺儲(chǔ)備液，用純水稀釋500 ng/mL的工作液，-20℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.3 供試品溶液的制備 取麻黃9 g，苦杏仁9 g，甘草9g，加水220mL，煎煮60min，濾出藥液，再加水160 mL，煎煮60 min，合并藥液，于-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 血漿樣品預(yù)處理 精密吸取血漿樣品100 μL，加入純水100 μL，500 μg/L內(nèi)標(biāo)溶液100 μL，0.1mol/L碳酸鈉溶液100 μL，渦旋30 s，再加入乙酸乙酯800 μL，渦旋2 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液650 μL，40℃水浴氮?dú)獯蹈桑?00 μL甲醇復(fù)溶，超聲1 min，13 000 r/min離心5 min，取上清液10 μL進(jìn)行HPLCMS/MS分析。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 方法專屬性 取大鼠的空白血漿100 μL，按“2.4”項(xiàng)下方法操作，獲得大鼠空白血漿樣品色譜圖1A；將一定濃度的混合對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加入至空白血漿中，依同法操作，得色譜圖1B；取大鼠給藥后的血漿樣品，同法操作，得色譜圖1C。其中麻黃堿、偽麻黃堿和內(nèi)標(biāo)鹽酸苯丙醇胺的保留時(shí)間分別為6.04、6.85、3.88 min。結(jié)果表明，血漿中內(nèi)源性成分不干擾麻黃堿、偽麻黃堿和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定，結(jié)果見圖1。

圖1 麻黃堿、偽麻黃堿和鹽酸苯丙醇胺HPLC-MS/MS譜圖

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及定量限 取大鼠空白血漿100 μL，精密加入不同量的混合工作液，配制麻黃堿、偽麻黃堿終濃度為10 000、5 000、1 000、500、100、50、20 μg/L的血漿樣品，按“2.4”項(xiàng)下進(jìn)行處理與測(cè)定，記錄待測(cè)物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積，利用待測(cè)物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積比對(duì)樣品血藥濃度進(jìn)行線性回歸，用加權(quán)（1/X2）最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算,得麻黃堿的線性回歸方程為Y=0.001 46X+0.113，r=0.993 4，偽麻黃堿的線性回歸方程為Y= 0.001 73X+0.048 7，r=0.992 9，麻黃堿和偽麻黃堿的線性范圍均為20～10 000 μg/L，以S/N≥10為最低定量限，S/N≥3為最低檢測(cè)限，測(cè)得麻黃堿、偽麻黃堿最低定量限為10 μg/L，最低檢測(cè)限為1 μg/L。

2.5.3 基質(zhì)效應(yīng) 取大鼠空白血漿，按“2.4”項(xiàng)下進(jìn)行處理得空白基質(zhì)殘?jiān)?，精密加入一定濃度的麻黃堿、偽麻黃堿工作液，配制成各待測(cè)物終濃度分別為50、1 000、10 000 μg/L的血漿樣品，測(cè)定各待測(cè)物峰面積（A1）。另取上述等量的3個(gè)濃度的麻黃堿、偽麻黃堿工作液與水配制成各待測(cè)物終濃度為50、1 000、10 000 μg/mL的對(duì)照樣品，同法操作，測(cè)得各待測(cè)物峰面積(A0)，每個(gè)濃度平行操作3份。按基質(zhì)效應(yīng)=A1/A0計(jì)算，得麻黃堿、偽麻黃堿低、中、高3個(gè)濃度的基質(zhì)效應(yīng)介于95.6%～102.1%，內(nèi)標(biāo)基質(zhì)效應(yīng)為98.3%，RSD值為4.2%。表明本方法可有效地避免大鼠血漿中的基質(zhì)效應(yīng)。

2.5.4 精密度和回收率實(shí)驗(yàn) 取大鼠空白血漿，精密加入一定濃度的麻黃堿、偽麻黃堿工作液，配制麻黃堿、偽麻黃堿的終濃度分別為50、1 000、10 000 μg/L的低、中、高質(zhì)控樣品，按“2.4”項(xiàng)下處理與測(cè)定，測(cè)得麻黃堿、偽麻黃堿峰面積（Ae）。取上述3個(gè)濃度的麻黃堿、偽麻黃堿混合對(duì)照品溶液未經(jīng)提取直接進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得麻黃堿、偽麻黃堿峰面積（Ac），每個(gè)濃度平行操作5份，按Ae/Ac計(jì)算回收率，回收率介于64.7%～76.4%；每個(gè)濃度平行操作5份，連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算批內(nèi)、批間的精密度,得精密度RSD值小于5.3%。結(jié)果見表1。

2.5.5 穩(wěn)定性考察 取空白血漿100 μL，精密加入一定濃度的麻黃堿、偽麻黃堿工作液，配制成各待測(cè)物終濃度分別為50、1 000、10 000 ng/mL的血漿樣品，分別考察其在室溫放置0、12、24 h，-20℃冷凍0、3、7 d和反復(fù)凍融3次的穩(wěn)定性。將測(cè)定的峰面積比代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算質(zhì)控樣品血漿實(shí)測(cè)值之間的相對(duì)差異，在上述條件下麻黃堿穩(wěn)定性RSD值0.6%～6.4%；偽麻黃堿穩(wěn)定性RSD值1.3%～5.9%，結(jié)果表明，麻黃堿和偽麻黃堿在室溫放置、長(zhǎng)期冷凍和凍融循環(huán)條件下均穩(wěn)定。

表1 麻黃堿和偽麻黃堿在大鼠血漿中的回收率及精密度(±s，n=5)

表1 麻黃堿和偽麻黃堿在大鼠血漿中的回收率及精密度(±s，n=5)

回收率測(cè)定值（%）RSD（%） RSD（%） RSD（%）麻黃堿 50 74.6±2.22 3.3 4.0 4.7 1 000 76.4±2.07 3.0 2.1 2.2 10 000 71.7±2.69 2.6 1.0 4.7偽麻黃堿 50 64.7±2.01 3.5 3.7 4.1 1 000 69.5±3.31 5.3 0.7 3.3 10 000 69.8±3.19 5.2 2.9 3.2藥物名稱 質(zhì)量濃度（μg/L）日間精密度日內(nèi)精密度

2.6 藥動(dòng)學(xué)研究 雄性SD大鼠8只，體質(zhì)量200～ 230 g，禁食12 h，自由飲水。將供試品溶液按9 mL/kg灌胃給藥，分別于給藥前及給藥后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24 h經(jīng)眼球后靜脈叢取血0.3 mL，置于經(jīng)肝素處理的干燥離心管中，4 000 r/min離心10 min，取血漿0.1 mL用于處理、分析，測(cè)得麻黃堿、偽麻黃堿平均血藥濃度-時(shí)間曲線，見圖2。采用DAS軟件進(jìn)行房室模型擬合，結(jié)果表明各組中麻黃堿、偽麻黃堿在大鼠體內(nèi)呈一室模型，同時(shí)計(jì)算大鼠單次口服三拗湯后麻黃堿、偽麻黃堿的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表2。

3 討論

圖2 大鼠單次灌服三拗湯后麻黃堿、偽麻黃堿血藥濃度-時(shí)間曲線圖(n=8)

麻黃堿和偽麻黃堿互為旋光異構(gòu)體，為確保較好的分離效果且不受血漿中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，實(shí)驗(yàn)以乙腈-甲酸水為流動(dòng)相，考察了不同比例和pH對(duì)質(zhì)譜響應(yīng)的影響，最終確定流動(dòng)相比例為乙腈-0.1%甲酸水（4∶96），在該色譜條件下可同時(shí)測(cè)定麻黃堿和偽麻黃堿且分離效果良好。實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察了在流動(dòng)相中加入不同量的甲酸氨對(duì)質(zhì)譜響應(yīng)的影響，結(jié)果表明流動(dòng)相中的甲酸氨對(duì)離子響應(yīng)影響不大。

表2 大鼠灌服三拗湯后麻黃堿、偽麻黃堿主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(±s，n=8)

表2 大鼠灌服三拗湯后麻黃堿、偽麻黃堿主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(±s，n=8)

藥動(dòng)學(xué)參數(shù) Tmax（h） Cmax（μg/L） Ke（1/h） T1/2（h）麻黃堿 2.28±1.01 1 432±332 0.14±0.03 5.16±1.43偽麻黃堿 3.06±0.94 380±122 0.18±0.06 4.26±1.62藥動(dòng)學(xué)參數(shù) AUC0-tn（h·μg）/L AUC0-∞（h·μg）/L麻黃堿 14 676±4 512 15 785±5 288偽麻黃堿 2 887±1 169 3 590±1 428

通過對(duì)血漿預(yù)處理方法的考察，發(fā)現(xiàn)固相萃取法（SPE）回收率較低，成本較高，蛋白沉淀法（PPT）會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的基質(zhì)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)最終采用液－液萃取法（LEE）對(duì)麻黃生物堿的血漿樣本進(jìn)行處理，且對(duì)不同的萃取溶劑乙酸乙酯、乙醚、氯仿、正己烷-二氯甲烷-異丙醇等進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯萃取后血漿內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)麻黃堿及偽麻黃堿的測(cè)定影響最小，且提取回收率較其他溶劑無明顯差異。同時(shí)還考察了氫氧化鈉和碳酸鈉溶液堿化血漿樣品的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用氫氧化鈉作堿化液時(shí)提取回收率不穩(wěn)定，采用最小濃度為0.1 mol/L的碳酸鈉溶液作堿化液時(shí)提取回收率較穩(wěn)定。

[1] 徐士偉.感冒后咳嗽臨證治驗(yàn)[J].天津中醫(yī)藥,2011,28(2): 133-134.

[2]魏慧利,于文濤.楊牧祥教授治療支氣管哮喘的臨床經(jīng)驗(yàn)[J].天津中醫(yī)藥,2011,28(2):93-94.

[3]閻麗娟,李媛媛,陳爽白.淺談麻黃的功效[J].天津中醫(yī)藥, 2011,28(4):317-319.

[4] 陳 慧.三拗湯加減治療小兒寒飲停肺型哮喘臨床觀察[J].天津中醫(yī)藥,2006,23(1):29-30.

[5]劉恩順,孫曾濤.麻芩咳喘合劑對(duì)支氣管哮喘治療效果及炎性物質(zhì)的影響[J].天津中醫(yī)藥,2007,24(1):452-455.

[6]馬永鈞,李瓊琳,王偉峰,等.毛細(xì)管電泳-電致化學(xué)發(fā)光法分離測(cè)定麻黃中的麻黃堿、偽麻黃堿與甲基麻黃堿[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2012,31(2):127-132.

[7]俞勵(lì)平,王曉可,羅佳波.毛細(xì)管電泳法測(cè)定麻杏石甘湯中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿和鹽酸甲基麻黃堿的含量[J].中藥材,2011,34(4):620-623.

[8]徐 靜，李 軍，胡 強(qiáng)，等.毛細(xì)管電泳/發(fā)光二極管誘導(dǎo)熒光法測(cè)定麻黃中麻黃堿偽麻黃堿含量[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2012,31(8):977-981.

[9]孫國(guó)祥，孫麗娜.毛細(xì)管區(qū)帶電泳法測(cè)定麻黃中麻黃堿和偽麻黃堿的含量[J].中南藥學(xué),2009,7(10):773-776.

[10]丁佳佳，李征征，宋粉云.毛細(xì)管電泳法測(cè)定千柏鼻炎片中鹽酸麻黃堿%鹽酸偽麻黃堿和鹽酸甲基麻黃堿的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012,18(10):120-123.

[11]Makino Y.Simple HPLC method for detection of trace ephedrine and pseudoephedrine in high-purity methamphetamine[J].Biomed Chromatogr,2012,26(3):327-330.

[12]張志鵬,朱勝山,李苑山,等.大鼠血漿中麻黃堿偽麻黃堿含量的高效液相色譜測(cè)定[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2012,23 (8):1878-1880.

[13]張建軍,歐麗娜,李 偉,等.小青龍顆粒中麻黃堿及偽麻黃堿在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2012,25(12):1991-1995.

[14]葛 斌,羅燕梅,徐愛霞,等.HPLC測(cè)定麻黃藥材中麻黃堿與偽麻黃堿的含量[J].中華中醫(yī)藥雜志,2008,43(3): 173-175.

[15]張 俐,王 玉.高效液相色譜法測(cè)定鼻炎康片中麻黃堿和偽麻黃堿的含量[J].中南藥學(xué),2013,10(11):761-764.

[16]賀 豐,羅佳波,陳飛龍,等.GC-MS法研究麻黃湯中麻黃堿偽麻黃堿的人體內(nèi)過程[J].中藥新藥與臨床藥理,2004, 15(5):336-347.

[17]李吉來,陳飛龍,劉傳明,等.麻黃湯中麻黃堿與偽麻黃堿的GC-MS法測(cè)定及配伍因素對(duì)湯劑中該成分含量的影響[J].中草藥,2002,33(4):21-23.

[18]趙 婕，邵 兵，孟 娟，等.氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定保健食品中的麻黃堿和偽麻黃堿[J].色譜,2004,22(2):188.

[19]呂 霞,郭 青,鐘文英.色譜法在麻黃生物堿手性分析中的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代藥物與臨床,2011,26(3):181-187.

Simultaneous determination of ephedrine and pseudoephedrine in rat’plasma and their pharmacokinetics determined by LC-MS/MS

DOU Ting1,OUYANG Hui-zi2,WANG Xing-Rui1,BO Fang1,HE Jun1
（1.Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine,Institute of Traditional Chinese Medicine,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;2.The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China）

[Objective]To develop a LC-MS/MS method for the determination of ephedrine and pseudoephedrine in rat’s plasma simultaneously and to study the pharmacokinetics of ephedrine and pseudoephedrine of rat’s plasma after oral administration of SD(Sanao Decoction).[Methods]The blood plasma samples were extracted through alkali and ethyl acetate liquid-liquid.Phenylalanine hydrochloride was used as the internal standard.Separation was performed using an Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm).The analytical column was acetonitrile-0.1%formic acid in water solution(4:96).Electrospray ionization(ESI)source was applied and operated in the positive ion mode.Multiple reaction monitoring(MRM)mode with the transitions of m/z 166.2→m/z 148.2,m/z 166.2→m/z 148.2 and m/z 152.1→m/z 134.1 were used to quantify ephedrine,pseudoephedrine and phenylalanine hydrochloride,respectively.[Results]The linearity ranged from 20 to 10 000 μg/L.RSD for inter-match and intra-match were not more than 5.3%and the average extracted recovery for all the high,middle and low concentration was more than 64.7%.[Conclusion]The analytical method is proved to be special,sensitive,rapid and suitable for the pharmacokinetic study of ephedrine and pseudoephedrine.

ephedrine;pseudoephedrine;pharmacokinetic;Sanao decoction;LC-MS/MS

R285.5

：A

：1673－9043（2014）06－0355-04

2014-08-14）

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.06.10

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目（20131210 120015）；天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金計(jì)劃項(xiàng)目（20110212）。

竇 婷（1989－），女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)樗幬锓治觥?/p>

何 俊，E-mail:hejun673@163.com。