UPLC法測(cè)定人參流動(dòng)浸膏中8種人參皂苷類成分*

李 薇，吉利娜，宋新波

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.天津中一制藥有限公司，天津 300193）

UPLC法測(cè)定人參流動(dòng)浸膏中8種人參皂苷類成分*

李 薇1，2，吉利娜1，宋新波1，2

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.天津中一制藥有限公司，天津 300193）

[目的]建立同時(shí)測(cè)定人參流動(dòng)浸膏中8種人參皂苷類成分含量的超高效液相色譜法（UPLC）方法。[方法]采用Waters Acqutity UPLC色譜系統(tǒng)，Acqutity UPLC?BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫，流速0.6 mL/min，柱溫40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm。[結(jié)果]人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3和Rd分別在0.009 7～0.291 0 μg，0.008 5～0.255 0 μg，0.0075～0.300 0 μg，0.010 4～0.416 0 μg，0.010 7～0.428 0 μg，0.007 4～0.296 0 μg, 0.004 2～0.168 0 μg和0.009 1～0.364 0 μg范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為101.4%、101.1%、100.1%、99.8%、99.3%、98.8%、98.8%和100.5%。[結(jié)論]方法快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為人參流動(dòng)浸膏的質(zhì)量控制提供快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

人參流動(dòng)浸膏；人參皂苷；UPLC；含量測(cè)定

人參為五加科人參（Panax ginseng C.A.Mey.）的干燥根，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為人參是“補(bǔ)氣第一要藥”，《神農(nóng)本草經(jīng)》中歸人參為上品，認(rèn)為人參具有“主補(bǔ)五臟、安精定魄、止驚除邪、明目益智、久服延年”之功[1]。人參中主要有效成分是人參皂苷[2-3]。皂苷類成分的質(zhì)量控制方法同常有紫外分光光度法、薄層掃描法、高效液相色譜法（HPLC）等[4]。2010版《中國(guó)藥典》采用HPLC對(duì)人參藥材中的3種成分進(jìn)行測(cè)定[5]。人參流動(dòng)浸膏是將6年生人參根進(jìn)行提取、濃縮制成的人參制品，在韓國(guó)以及歐美都有很大的認(rèn)可度?，F(xiàn)在國(guó)際上較為認(rèn)可的人參制品質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)是將產(chǎn)中含量較高的8種人參皂苷類成分的含量相加。超高效液相色譜（UPLU）是近幾年開(kāi)始被廣泛應(yīng)用的一種技術(shù)，它的色譜柱塔板數(shù)和分離度高于HPLC，具有分析時(shí)間短，節(jié)約流動(dòng)相的特點(diǎn)[6-7]。

本研究應(yīng)用UPLC方法，建立了同時(shí)測(cè)定人參流動(dòng)浸膏中人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd共8種成分的方法，具有較強(qiáng)的應(yīng)用性。

1 儀器與試藥

Waters Acqutity UPLC高效液相色譜儀，Acqutity H-class四元溶劑系統(tǒng)，F(xiàn)TN樣品管理器，PDA檢測(cè)器，Empower3色譜工作站（美國(guó)WATERS公司）。Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。KQ-250DE超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司，250 W，40 kHz）。AG-285型十萬(wàn)分之一天平（瑞士Mettler Toledo儀器有限公司）。標(biāo)準(zhǔn)品：人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2、Rb3、Rd（批號(hào)分別為：201027、201123、200703、201122、200802、200501、201001，中國(guó)藥品生物制品檢定所）。人參皂苷Rc（批號(hào)：R-008-120628，成都瑞芬思生物科技有限公司，≥98%）。乙腈、甲醇（色譜純，Thermo Fisher Scientific Inc.），超純水。人參流動(dòng)浸膏（批號(hào)：130520、130525、130610、130620、130625），提供單位：天津中一制藥有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Acqutity UPLC?BEH C18（1.7 μm, 2.1 mm×50 mm）。流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），線性梯度洗脫，0～3 min，19%A；3～3.8 min，19%～28%A；3.8～7.8 min，28%～32%A；7.8～11.8 min，32%～45%A；11.8～14 min，45%～502%A。流速0.6 mL/min，柱溫40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm。標(biāo)準(zhǔn)品和供試品UPLC圖見(jiàn)圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備 精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd，加甲醇制成每1mL分別含上述成分0.097、0.085、0.075、0.104、0.107、0.074、0.042和0.091 mg的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，備用。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(A)及人參流動(dòng)浸膏供試品溶液（B）的UPLC圖Fig.1 UPLC chromatograms of reference substances(A) and Ginseng extract sample(B)

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取供試品人參流動(dòng)浸膏1.0 g，置具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL，稱質(zhì)量，超聲（250 W，40 kHz）30 min，放置至室溫，稱定質(zhì)量，加入甲醇，補(bǔ)足失質(zhì)量，濾過(guò)。取續(xù)濾液10mL，蒸干，用甲醇溶解殘?jiān)⑥D(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，加甲醇稀釋至2 mL，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 線性與范圍 精密吸取2.2.1項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別取0.1、0.2、0.5、1、2、3、4 μL，注入超高效液相色譜儀，平行測(cè)定2次。分別以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，8種樣品峰面積積分值為縱坐標(biāo)，計(jì)算得線性回歸方程，數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 人參8種皂苷的線性方程和范圍Tab.1 Regression equations and ranges of eight ginsenosides

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.2.1項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在2.1項(xiàng)下條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，每次1 μL，測(cè)定8種人參皂苷的峰面積，其RSD分別為0.52%、0.89%、1.2%、0.64%、0.73%、1.0%、0.69%和0.88%，儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 按2.2.2項(xiàng)下方法制備同一批號(hào)的供試品溶液，分別于制備后第0、2、4、8、16、24 h測(cè)定，測(cè)定8種人參皂苷峰面積，其RSD分別為1.1%、1.4%、1.3%、1.2%、1.0%、1.6%、1.2%和1.4%，表明供試品溶液在制備后的24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按供試品溶液制備方法平行制備同一批號(hào)的6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分析，計(jì)算人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3和人參皂苷Rd的含量分別為0.49、1.24、0.44、3.36、2.13、1.84、0.26和1.54 mg/μg，其RSD分別為1.6%、2.0%、2.2%、1.6%、2.4%、2.5%、3.2%和2.1%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.7 加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密稱取已測(cè)得含量的人參流動(dòng)浸膏樣品0.5 g，按2.2.2項(xiàng)下方法，加入與含量等量的標(biāo)準(zhǔn)品制成樣品含量與標(biāo)準(zhǔn)品量1∶1的6組供試品溶液，按2.1項(xiàng)下條件分析，計(jì)算加樣回收率及RSD。測(cè)得人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd和人參皂苷Rg3的回收率為101.4%、101.1%、100.1%、99.8%、99.3%、98.8%、98.8%和100.5%，RSD為 1.7%、1.0%、1.9%、2.3%、2.2%、1.8%、1.0%和1.0%。

2.8 樣品的測(cè)定 精密稱取人參流動(dòng)浸膏約0.1 g，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算人參流動(dòng)浸膏中8種人參皂苷類成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 人參流動(dòng)浸膏中人參皂苷類成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tab.2 The contents of ginsenosides in Ginseng extract mg/g

3 討論

本研究首次利用UPLC法對(duì)人參流動(dòng)浸膏中的8種人參皂苷類成分進(jìn)行同步測(cè)定。已有文獻(xiàn)使用HPLC法測(cè)定人參藥材中的8中人參皂苷的含量[8-10]，但是每個(gè)檢測(cè)時(shí)間都在100 min以上，在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中非常不便。本實(shí)驗(yàn)建立的UPLC方法，8個(gè)成分同時(shí)測(cè)定的測(cè)定時(shí)間在10 min之內(nèi)，較HPLC法縮短了90%，而且節(jié)約溶劑，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

本研究分別考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸水、乙腈-0.1%甲酸水系統(tǒng)等不同的梯度洗脫系統(tǒng)。在乙腈-水系統(tǒng)下，8種人參皂苷類成分的分離度均大于1.5，且峰形較好。因此采用乙腈-水為本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相。比較了25、30和40℃等不同色譜柱溫度下的分離效果，結(jié)果表明，40℃下柱壓較低且分離效果最佳，因此確定的柱溫為40℃。

有文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)于測(cè)定時(shí)采用何種提取方法尚無(wú)定論[11-12]，常見(jiàn)的提取方法有超聲提取和回流提取，本實(shí)驗(yàn)對(duì)兩種提取方式進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)兩種提取方法提取效果相當(dāng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。超聲提取相對(duì)于回流提取具有操作簡(jiǎn)便，速度快，節(jié)約能耗的優(yōu)點(diǎn)，因此本實(shí)驗(yàn)采用超聲提取的方法對(duì)人參流動(dòng)浸膏進(jìn)行提取。經(jīng)過(guò)對(duì)不同提取溶媒、不同提取時(shí)間以及溶媒用量的提取效果的考察，最終確定以供試品料液比50倍量（g/mL）的甲醇作為提取溶媒，超聲提取30 min作為本實(shí)驗(yàn)的提取方式。

綜上所述，同時(shí)測(cè)定人參中8種人參皂苷的含量，不但可以更加準(zhǔn)確的測(cè)定人參制品的中人參皂苷的含量，還可以通過(guò)8種皂苷之間的比例判斷人參制品的原料來(lái)源[13-14]，因此具有很強(qiáng)的應(yīng)用性。

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Determination of eight ginsenosides in Ginseng extract by UPLC

LI Wei1，2,JI Li-na1,SONG Xin-bo1，2
（1．Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China; 2.Tianjin Zhong Yi Pharmaceutical Co.,Ltd.,Tianjin 300193,China）

[Objective]To develop a ultra-high performance liquid chromatography method for simultaneously determination of eight ginsenosides in Ginseng extract.[Methods]The analysis was performed on a Waters Acqutity UPLC system eluted with mobile phases of acetonitrile and water in gradient mode.The column was Acqutity UPLC?BEH C18(1.7 μm,2.1 mm×50 mm).The flow rate was 0.6 mL/min. The column temperature was set at 40℃and the detection wavelength was set at 203 nm.[Results]Good linearity was obtained in the range of 0.009 7～0.291 0 μg,0.008 5～0.255 0 μg,0.007 5～0.300 0 μg,0.010 4～0.416 0 μg,0.010 7～0.428 0 μg,0.007 4～0.296 0 μg, 0.004 2～0.168 0 μg and 0.009 1～0.364 0 μg for ginsenoside Rg1，Re，Rf，Rb1，Rc，Rb2，Rb3 and Rd respectively.The method recoveries of eight compounds were 101.4%,101.1%,100.1%,99.8%,99.3%,98.8%,98.8%and 100.5%respectively.[Conclusion] The established method can rapidly receive an accurate and reproducible result used for controlling the quality of Ginseng extract.

Ginseng extract;ginsenoside;UPLC;assay

R284.1

A

1672-1519（2014）10-0624-03

2014-04-30）

（本文編輯：高 杉，于春泉）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.10.13

科技創(chuàng)新體系及條件平臺(tái)建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目（12TXG CCX03800）。

李 薇（1983-），女，碩士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事天然藥物制藥工藝及質(zhì)量控制方面的研究。

宋新波，E-mail:songxinbo@tjutcm.edu.cn。