李鐵成，馬寶豐，李德生，艾麗麗，艾 浩

（遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院，錦州 121000）

·中藥研究·

黃芪甲苷對大鼠肝缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用*

李鐵成，馬寶豐，李德生，艾麗麗，艾 浩

（遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院，錦州 121000）

[目的]研究黃芪甲苷對肝缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。[方法]將雄性SD大鼠36只，隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組（Sham組）、肝缺血/再灌注組（I/R組）、黃芪甲苷預(yù)處理組（AsIV組）。分光光度法測定大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性；蘇木精-伊紅（HE）染色觀察肝組織形態(tài)學(xué)變化，蛋白印跡法（Western blot）檢測心肌組織內(nèi)Bax,Bcl-2蛋白表達(dá)。[結(jié)果]與假手術(shù)組比較，肝I/R組ALT、AST活性顯著增高，Bax蛋白表達(dá)增加，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，黃芪甲苷預(yù)處理可以降低肝缺血/再灌注損傷引起的ALT、AST活性增高，Bax蛋白表達(dá)增加，增加Bcl-2蛋白表達(dá)。[結(jié)論]黃芪甲苷預(yù)處理對肝缺血/再灌注損傷有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與黃芪甲苷抑制肝細(xì)胞凋亡有關(guān)。

黃芪甲苷；肝缺血/再灌注損傷；細(xì)胞凋亡

肝缺血/再灌注損傷指各種原因?qū)е赂闻K血流中斷或不足使肝臟缺血，當(dāng)恢復(fù)血供再灌注后，肝細(xì)胞的功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞反而加重。通過傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)手段防治組織的缺血/再灌注損傷具有重要的臨床意義。中藥黃芪是豆科植物蒙古黃芪或莢膜黃芪的干燥根，味甘，性溫，乃補(bǔ)氣之圣藥。黃芪甲苷是從黃芪中分離得到的一種具有多種藥理活性的皂苷類化合物，其具有抗炎抗氧化、抗自由基、降血糖血脂、器官保護(hù)等廣泛的藥理作用[1-4]。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷具有抗乙型肝炎病毒的潛力，保護(hù)肝臟免受病毒侵害[5]。在肝移植的大鼠模型中，黃芪甲苷的預(yù)處理可以通過降低腫瘤壞死因子-α（TNF－α），抑制核因子－κB（NF－κB）轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而減輕肝移植術(shù)后缺血/再灌注損傷的程度，提高術(shù)后存活率[6]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡是肝缺血/再灌注損傷中重要的病理過程，黃芪甲苷是否可以通過抑制肝細(xì)胞凋亡進(jìn)而發(fā)揮對缺血肝臟的保護(hù)作用，目前尚不清楚。本研究擬建立大鼠肝缺血/再灌注損傷模型，進(jìn)一步探討黃芪甲苷對肝臟的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級成年雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量（260±40）g，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號：SCXK（遼）2009-0004。

1.2 藥品與試劑 黃芪甲苷，成都曼斯特生物科技有限公司。谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。Bax,Bcl-2一抗購自SANTA CRUZ公司。

1.3 分組及給藥 36只SD大鼠隨機(jī)分為：1）假手術(shù)組（Sham組）：只開腹不阻斷血流。2）肝缺血/再灌注組（I/R組）。3）黃芪甲苷預(yù)處理組60mg/kg（AsIV組）。黃芪甲苷預(yù)處理組手術(shù)前5 d開始灌胃給藥，每日1次。模型組和假手術(shù)組灌等體積的生理鹽水。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 模型制備 大鼠手術(shù)前12 h禁食，自由飲水，仰臥位固定麻醉。上腹部正中切口，顯露第一肝門，用小號無創(chuàng)傷血管夾鉗夾肝蒂，阻斷門靜脈,肝動(dòng)脈和膽總管，造成肝缺血，同時(shí)腹腔注射（ip）給予肝素每只200 U防治凝血，30 min后松開血管夾恢復(fù)肝血供，關(guān)閉腹腔分別在各時(shí)間點(diǎn)取血液和肝組織標(biāo)本。

1.4.2 AST、ALT活性測定 分別于術(shù)前，再灌注2、4、6 h取血，按試劑說明書操作測定各組大鼠血清中AST、ALT含量。

1.4.3 肝組織形態(tài)學(xué)觀察 再灌注6 h后，取缺血區(qū)肝組織于4%的多聚甲醛中固定12 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。石蠟橫斷面連續(xù)切片5～6片，厚度約5 μm，切片常規(guī)脫蠟脫水，常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色，普通光學(xué)顯微鏡觀察肝臟組織病理改變。

1.4.4 Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)測定 再灌注6 h后，取缺血區(qū)肝組織置于-70℃冰箱備用。測定時(shí)取出樣品，放入裂解液超聲裂解組織，離心，取上清液，采用二喹啉甲酸法（BCA法）進(jìn)行蛋白定量。然后每組取10 μL樣品以及蛋白標(biāo)準(zhǔn)物點(diǎn)樣，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，初始電壓為90 V，觀察Maker的移動(dòng)情況，適時(shí)終止電泳。轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜，切割后分別與其特定的稀釋過的Bax,Bcl-2一抗4℃雜交過夜，然后用洗膜液洗膜3次，與二抗反應(yīng)至少1 h，再次洗膜3次，加ECL顯色，上機(jī)檢測。

1.4.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析結(jié)果，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較時(shí)，若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’s T3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALT、AST活性的測定 肝缺血/再灌注后肝功能指標(biāo)AST、ALT持續(xù)增高，黃芪甲苷預(yù)處理可以在不同時(shí)間點(diǎn)不同程度的降低AST、ALT活性（P< 0.05），提示黃芪甲苷的預(yù)處理對肝缺血/再灌注的肝功能有一定的保護(hù)作用。見表1、表2。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)ALT活性的變化（±s）Tab.1 The activity of ALT at different time points（±s）U/L

表1 不同時(shí)間點(diǎn)ALT活性的變化（±s）Tab.1 The activity of ALT at different time points（±s）U/L

注：與Sham組比較，*P<0.05；與I/R組比較，＃P<0.05。

組別 n Sham組 12 65±12 70±13 64±16 59±11 I/R組 12 68±18 367±32* 752±142* 1 087±121* AsIV組 12 78±17 98±15＃109±24＃128±29＃0 h 2 h 4 h 6 h

表2 不同時(shí)間點(diǎn)AST活性的變化（±s）Tab.2 The activity of AST at different time points（±s）U/L

表2 不同時(shí)間點(diǎn)AST活性的變化（±s）Tab.2 The activity of AST at different time points（±s）U/L

注：與Sham組比較，*P<0.05；與I/R組比較，＃P<0.05。

組別 n Sham組 12 50±12 63±14 47±11 64±10 I/R組 12 63±13 312±18* 789±56* 1 247±89* AsIV組 12 69±12 74±19＃132±34＃153±121＃0 h 2 h 4 h 6 h

2.2 肝組織形態(tài)學(xué)的變化 假手術(shù)組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰，以中央經(jīng)脈為中心肝細(xì)胞呈放射狀排列，胞漿深染，匯管區(qū)無炎性細(xì)胞侵潤。模型組肝組織中大量炎性細(xì)胞聚集浸潤，以中央靜脈為甚，肝竇變窄，肝索排列紊亂，可見肝細(xì)胞水腫及空泡樣變性，偶見點(diǎn)狀壞死。黃芪甲苷預(yù)處理可部分改善上述肝組織的形態(tài)學(xué)變化。

2.3 黃芪甲苷對Bax,Bcl-2蛋白的影響 見圖2。示肝臟缺血/再灌注后抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)降低、促凋亡基因Bax表達(dá)增加。而黃芪甲苷預(yù)處理可以部分逆轉(zhuǎn)上述改變，提示黃芪甲苷預(yù)處理可以抑制肝缺血/再灌損傷中凋亡的發(fā)生。

圖1 肝組織形態(tài)學(xué)變化Fig.1 The changes of liver pathological

圖2 Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)Fig.2 The protein expression of Bax,Bcl-2

3 討論

肝缺血/再灌注損傷在臨床上比較常見，如肝腫瘤切除、肝移植、休克等，是導(dǎo)致肝功能衰竭的重要原因，目前認(rèn)為其發(fā)生機(jī)制可能與氧自由基爆發(fā)、微循環(huán)功能障礙、凋亡及炎癥因子的激活等密切相關(guān)[7-9]。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠肝缺血/再灌注模型，觀察了黃芪甲苷預(yù)處理對肝缺血/再灌注損傷時(shí)肝細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，黃芪甲苷預(yù)處理可以不同程度的降低缺血/再灌注后AST、ALT含量，抑制肝組織的形態(tài)學(xué)變化，提示黃芪甲苷預(yù)處理對肝缺血/再灌注損傷有一定的保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡形式之一，近來發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡與肝缺血/再灌注損傷密切相關(guān)，采取有效的措施干預(yù)細(xì)胞凋亡，可減輕肝臟缺血/再灌注損傷。Bcl-2家族是細(xì)胞通過線粒體途徑促進(jìn)凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，Bcl-2家族有兩個(gè)重要的凋亡調(diào)控因子，即Bax和Bcl-2。Bax主要分布在線粒體外膜上，它的過表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而Bcl-2是抗凋亡因子，當(dāng)Bax表達(dá)量高時(shí)，形成同源二聚體Bax/Bax，抑制Bcl-2的抗凋亡作用，而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10-12]。研究發(fā)現(xiàn)對肝缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用可通過增加Bcl-2表達(dá)，抑制Bax表達(dá)實(shí)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)通過電泳法探討了黃芪甲苷對Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示肝缺血/再灌注后Bcl-2表達(dá)降低，而Bax表達(dá)增加，與模型組相比黃芪甲苷預(yù)處理則可增加抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，抑制促凋亡基因的表達(dá)，抑制凋亡信號的傳導(dǎo)，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用。

有報(bào)道黃芪甲苷的預(yù)處理可抑制炎癥反應(yīng)，抑制NF-κB通路的活化，預(yù)防小鼠肝臟缺血/再灌注損傷的發(fā)生[13]。黃芪甲苷大鼠常用劑量為20～80mg/kg[14]，本研究結(jié)合前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果探討了60 mg/kg黃芪甲苷在整體動(dòng)物水平上對肝缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用，結(jié)果提示黃芪甲苷可能通過抑制肝細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮對肝缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用，這一結(jié)論為中藥黃芪的開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Protective effect of Astragaloside IV against liver ischemia and reperfusion injury in rats

LI Tie-cheng,MA Bao-feng,LI De-sheng,AI Li-li,AI Hao
（The Third Affiliated Hospital of Liaoning Medical University,Jinzhou 121000,China）

[Objective]To investigate the protective effect of Astragaloside IV (As IV)against liver ischemia and reperfusion injury and the underlying mechanism.[Methods]The 36 SD rats were randomly divided into 3 groups:sham operation group (Sham group),liver ischemia-reperfusion (I/R group)group and As IV group.The content of ALT and AST were measured by spectrophotometric method. Liver pathological changes were observed by HE staining.Bax and Bcl-2 protein expression was determined by Western blot.[Results] Compared with sham group,the content of ALT and AST was significantly increased,while the Bcl-2 protein expression decreased and the Bax expression increased.Pretreatment of As IV before liver I/R could decrease the content of ALT and AST,Bax expression,and increase the Bcl-2 protein expression(P＜0.05).[Conclusion]As IV pretreatment has a protective effect against liver ischemia reperfusion injury,which is partially finished via inhibiting liver cell apoptosis.

Astragaloside IV;liver ischemia reperfusion injury;cell apoptosis

R285.5

A

1672-1519（2014）10-0621-03

2014-05-15）

（本文編輯：高 杉，于春泉）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.10.12

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81173443）；遼寧省教育廳資助科研資助項(xiàng)目（LJQ2011087）。

李鐵成（1970－），男，博士，副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)閲g(shù)期器官保護(hù)。