王海龍，王豪，裴思竹，孟曉佳，閻沁，鄧玉林，馬宏

（北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081）

由于老年人口的不斷增加和生活水平的提高，腦血管病的發(fā)病率仍在不斷上升。并且隨著社會的發(fā)展，腦力工作者不斷增多，腦血管病對年輕人口的威脅也越來越大。統(tǒng)計資料表明：我國腦部疾病的發(fā)病率占人口的12.6%，其中腦血管疾病患者有3500萬，每年新增260萬。腦血管病的癥狀多見頭暈、頭痛、健忘、失眠、嗜睡、打哈欠、視物模糊等。治療方法可分為直接改善腦心供血和能量代謝的對癥治療，以及阻止動脈硬化進(jìn)程和消除狹窄閉塞血管的病因治療[1]。毋庸贅言，腦血管病嚴(yán)重威脅了人們的健康，而對其致病的機理了解甚少。

Autophagy 是凋亡之外的程序性細(xì)胞死亡方式，在進(jìn)化過程中高度保守，從酵母、果蠅到脊椎動物和人都可以找到參與autophagy 的同源基因。相對于主要降解短半衰期蛋白質(zhì)的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，細(xì)胞的自噬被認(rèn)為是參與絕大多數(shù)長半衰期蛋白質(zhì)降解的主要途徑[2,3]。當(dāng)環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)缺乏時，細(xì)胞通過自噬作用對胞內(nèi)大分子物質(zhì)進(jìn)行降解，提供維持細(xì)胞存活所需的最低能量[4]；某些毒素和病原體可通過自噬途徑被包裹、降解清除[5,6]；變性的胞漿成分，如因錯誤折疊而形成的凝聚蛋白或受損的細(xì)胞器也可通過自噬得到清除，從而使細(xì)胞免于受到進(jìn)一步損傷[7]。因此，在某些疾病的早期階段，激活自噬起到了阻止疾病進(jìn)展的作用。

然而，另有報道稱自噬還可參與Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，即非凋亡形式的程序性細(xì)胞死亡。在自噬形式的程序性細(xì)胞死亡中，中間絲與微絲重新分布，但并不降解，激動蛋白仍然保持聚合狀態(tài)，因此細(xì)胞骨架系統(tǒng)保持完好；與之相反，在凋亡形式的程序性細(xì)胞死亡中，很早就出現(xiàn)激動蛋白的解聚和中間絲的降解，細(xì)胞骨架系統(tǒng)遭到破壞[8]。TRAIL（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand）是腫瘤壞死因子（TNF）超家族的一個新成員，能夠通過經(jīng)典的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的通路特異地誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡而對大多數(shù)正常細(xì)胞沒有毒性[9,10]。本項研究假設(shè)在腦供血不足的情況下，負(fù)責(zé)供應(yīng)營養(yǎng)的星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)，從而誘發(fā)細(xì)胞自噬，而大量細(xì)胞自噬對TRAIL蛋白具有增進(jìn)分泌的調(diào)控作用，最終TRAIL蛋白對腦細(xì)胞的壞死發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、U251，U87細(xì)胞均為本課題組購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞中心的細(xì)胞株；MEM（Hyclone），胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS）（Hyclone）；TRIZOL（Invitrogen），乙醇、異丙醇、氯仿（分析純），逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega公司），抗LC3B、Caspase3抗體（Cell Signal），辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記抗鼠的二抗、HRP標(biāo)記抗兔的二抗、HRP標(biāo)記抗羊二抗分別購自中山生物技術(shù)公司，TRAIL ELISA分析試劑盒（R&D）?？梢?紫外分光光度計（Shimaozu，UV-2550），超聲細(xì)胞破碎儀（Cole-Pormer，CP100），倒置熒光顯微鏡（Olympus AO）。

1.2 MDC染色法

單丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色法，是自噬發(fā)生過程中分析分子水平機制的一種特異的檢測自噬體方法。具體操作為取饑餓不同時間點的U251細(xì)胞，加入終濃度0.05 mM MDC溶液， 37°C孵育10分鐘。PBS清洗三次后迅速用熒光顯微鏡分析，激發(fā)波長380/420 nm，陽性信號為藍(lán)綠色。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄PCR

按照說明書進(jìn)行R N A常規(guī)提取操作，測定R N A濃度，取等量R N A進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)結(jié)果通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，相關(guān)基因的引物序列為：DR5（Forward）： 5’-ATGGAACAACGGGGACAGAA-3’，DR5（Reverse）：5’- CAGGAGATGCAATCTCTACCG-3’；T N F S F 1 0 F (T R A I L, F o r w a r d)：5′-TCCTGGGAATCATCAAGGAG-3′，TNFSF10F (TRAIL,Reverse)：5′-ACTAAAAAGGCCCCGAAAAA-3′；BECN1（Forward）：,5′-GTCCTCCCCGTATCATACCATTC-3′，BECN1（Reverse）：5′-ACGATGGTAAAGGGAGGGAAGT-3′；mTOR（Forward）：, 5′-CGCTGTCATCCCTTTATCG-3′，mTOR（Reverse）：5′-ATGCTCAAACACCTCCACC-3′；ULK3（Forward）：, 5′- AAGGAGCAGGTCAAGATGAG-3′， U L K 3（R e v e r s e）：5′-G T G C A A G A G C TA C G A A C A G A -3′；G A P D H（Forward）：5’- CCTGCTTCACCACCTTCTTG -3’；GAPDH（Reverse）： 5’- CCATCACCATCTTCCAGGAG-3’。PCR反應(yīng)條件為：94℃，5 min；94℃ 40 s，52-60℃30 s，72℃ 30 s；72℃，10 min.

1.4 蛋白印記

培養(yǎng)72h的細(xì)胞常規(guī)方法離心收集后，加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白。蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳進(jìn)行分離和轉(zhuǎn)膜，蛋白質(zhì)印跡法檢測凋亡相關(guān)Caspase蛋白和自噬相關(guān)蛋白LC3B的表達(dá)情況，抗體濃度按試劑說明操作。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究中所有實驗數(shù)據(jù)采用 SPSS 12.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以mean±sd表示，不同處理組間比較采用單因素方差分析。*P﹤0.05，代表具有顯著性差異，每個實驗獨立重復(fù)三次，每次重復(fù)樣本數(shù)n≥3。

2 結(jié)果

2.1 饑餓條件誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞自噬

自噬體形成依賴的第二個泛素樣結(jié)合系統(tǒng)(Atg8)是位于自噬囊泡膜上，可與MDC特異結(jié)合，通過熒光染色，在熒光顯微鏡下可見陽性顯色。通過MDC染色，熒光顯微鏡下可以看到U251細(xì)胞的自噬在饑餓的情況下增強（圖1A）。通過自噬標(biāo)志性蛋白LC3B的進(jìn)一步westewn blot分析也可見U251細(xì)胞在饑餓的不同時間的自噬發(fā)生情況，即短時間的饑餓即有自噬發(fā)生（如4h），隨著饑餓時間的延長（4h～12h），自噬均維持在一個較高的水平（圖1B）。當(dāng)向培養(yǎng)基中加入血清，恢復(fù)正常營養(yǎng)條件后，可以看到自噬水平可以被回調(diào)至一個基礎(chǔ)水平（圖1B）。

用Quantity one軟件對LC3B蛋白的兩種亞型進(jìn)行灰度分析，可以看出在饑餓條件下的12h之內(nèi)，LC3B-Ⅱ型對LC3B-Ⅰ型的灰度比值一直大于2，說明了自噬發(fā)生的較顯著。而當(dāng)營養(yǎng)恢復(fù)后4h到12h之內(nèi)，LC3-Ⅱ型對LC3-Ⅰ型的灰度比值接近于1，回歸到一般水平。綜上實驗結(jié)果顯示，在饑餓模型下，星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞U251的自噬現(xiàn)象非常顯著，同時凋亡標(biāo)志性蛋白存在較明顯的水解活性。

2.2 饑餓引發(fā)凋亡相關(guān)TRAIL蛋白的分泌性表達(dá)

我們選取了兩種人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，通過同樣條件的饑餓處理，對其培養(yǎng)上清進(jìn)行了TRAIL蛋白的酶聯(lián)免疫分析，結(jié)果顯示U251細(xì)胞在饑餓條件下TRAIL蛋白的分泌量短時間內(nèi)（24h）提升顯著，隨著饑餓時間的進(jìn)一步延長TRAIL的表達(dá)恢復(fù)至基礎(chǔ)水平；相反另一種P53野生型的U87細(xì)胞在饑餓條件下的TRAIL蛋白分泌量一直保持在較高水平（圖2A）。

圖1饑餓條件下細(xì)胞自噬和凋亡水平的分析

同時，我們對饑餓的U251細(xì)胞內(nèi)與自噬和凋亡相關(guān)的信號分子的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示TRAIL基因在轉(zhuǎn)錄水平上得以上調(diào)，甚至在血清恢復(fù)12h后，TRAIL的表達(dá)水平依然在提高（圖2B）。這與TRAIL蛋白的分泌表達(dá)效應(yīng)相一致。因TRAIL是死亡誘導(dǎo)配體，故同時我們又檢測了其細(xì)胞表面受體DR5的表達(dá)情況，結(jié)果顯示饑餓的條件壓力下，細(xì)胞僅有TRAIL的表達(dá)發(fā)生變化。

mTOR 信號通路可影響基因轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)合成，在細(xì)胞生長增殖過程中起重要作用。在缺血饑餓狀態(tài)下，自噬的發(fā)生主要由mTOR 通路調(diào)控，即 mTOR 信號通路失活，從而激活自噬信號通路，因此短期缺血可加強新生鼠腦神經(jīng)細(xì)胞自噬和凋亡。激酶復(fù)合物ULK（UNC51-like）通過與mTOR的相互作用而將外界環(huán)境信號轉(zhuǎn)化為細(xì)胞自噬特異性信號，從而激活細(xì)胞自噬通路。另有文獻(xiàn)報道自噬在缺血期和再灌注期可能發(fā)揮不同作用，缺血初期主要起保護(hù)作用，而再灌注期自噬則引起細(xì)胞的損傷導(dǎo)致過量死亡[11]。為驗證TRAIL的表達(dá)可能與饑餓或饑餓恢復(fù)期引發(fā)的自噬相關(guān)，我們同時檢測了自噬相關(guān)信號通路分子mTOR和ULK3的變化。結(jié)果證明在饑餓處理早期mTOR的表達(dá)水平不降反升，而當(dāng)恢復(fù)血清供給后，mTOR和ULK3的表達(dá)明顯受到抑制，此時TRAIL的表達(dá)保持在較高的水平上。以上結(jié)果說明在饑餓和饑餓后恢復(fù)期均可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬，而且自噬發(fā)生過程中，有某種因素可能在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控了TRAIL蛋白表達(dá)，從而導(dǎo)致TRAIL的分泌水平增高。

圖2自噬和凋亡相關(guān)信號分子在饑餓和饑餓后恢復(fù)期內(nèi)的表達(dá)變化

圖3饑餓細(xì)胞TRAIL抗體封閉后光學(xué)顯微鏡下的細(xì)胞生長情況

2.3 TRAIL抗體可阻斷饑餓誘導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞的損傷

既然從上述結(jié)果可推測到饑餓處理或饑餓后恢復(fù)均有可能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生自噬，而且長時間饑餓條件應(yīng)激下細(xì)胞會出現(xiàn)損傷，該損傷過程中我們又觀察到高水平的TRAIL蛋白的轉(zhuǎn)錄和分泌表達(dá)，提示該種相關(guān)性可能參與了饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷用。因此我們用無血清培養(yǎng)基（MEM）替換人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞培養(yǎng)液，進(jìn)行培養(yǎng)72h后，向?qū)嶒灲M中加入TRAIL蛋白的抗體（0.5ng/mL）進(jìn)行封閉，從光鏡下可見與對照組相比，封閉TRAIL的實驗組中，U251細(xì)胞的細(xì)胞密度和細(xì)胞生長狀態(tài)明顯高于對照組，該結(jié)果間接證明了TRAIL蛋白在饑餓條件引發(fā)的細(xì)胞死亡中的重要作用。

3 討論

前期的實驗結(jié)果很好地符合了實驗預(yù)想，即在饑餓條件下，人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和U87細(xì)胞會發(fā)生自噬，這個過程中TRAIL蛋白的分泌量得到了提升，并且證明TRAIL蛋白在細(xì)胞死亡的過程中發(fā)揮了重要的作用。目前的問題有兩個，一是自噬與TRAIL蛋白的分泌究竟有沒有直接聯(lián)系，以及在饑餓條件下細(xì)胞是如何調(diào)控TRAIL蛋白的分泌的；二是饑餓模型對于腦缺血環(huán)境是否具有完全模擬意義。前一個問題有待更多的基礎(chǔ)研究，后一個問題是本項實驗的后續(xù)工作內(nèi)容，即動物模型。我們擬定對老鼠進(jìn)行一側(cè)頸動脈結(jié)扎的方法，來造成其半腦腦供血不足的情況，然后分別測定兩個半腦內(nèi)，腦細(xì)胞損傷情況以及TRAIL蛋白的分泌狀況等信息，通過對比來更進(jìn)一步地印證我們的實驗猜想，并完善對這個過程中的機理的認(rèn)識。

有文獻(xiàn)研究表明在缺血狀態(tài)下，氧和營養(yǎng)物質(zhì)供給下降，內(nèi)生ATP 水平也下降，激活 AMPK，同時抑制 mTOR，引起自噬增強。而在再灌注期，AMPK 激活和抑制mTOR不再起主導(dǎo)作用，而 Beclin1 的表達(dá)明顯上調(diào)，同時胞內(nèi)出現(xiàn)Ca2+濃度升高、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等，這些導(dǎo)致再灌注期的自噬增強[12]，而這種增強有可能導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)一步損傷。目前該損傷效應(yīng)的分子機制還不是很清楚，本文從凋亡相關(guān)誘導(dǎo)配體TRAIL蛋白的角度給出了初步的解釋，并可能為饑餓條件下細(xì)胞凋亡和自噬相互作用的研究提供新的思路。

致謝

本課題是在國家自然基金項目（31200636，11079054）的資助下完成的。

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