何 娟，曹培鑫，黃英子，劉延琳*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100）

冰酒（icewine）即冰葡萄酒，指環(huán)境溫度達(dá)到-8℃以下，葡萄在葡萄樹上自然冰凍，此時葡萄中的一部分水分蒸發(fā)，一部分結(jié)冰，葡萄汁的糖、酸得到濃縮，風(fēng)味、香氣變濃，將這種葡萄采摘、壓榨，流出少量濃縮的葡萄汁經(jīng)低溫保糖發(fā)酵而成的葡萄酒[1]。冰酒因其獨(dú)特、濃郁、甜香醇厚的風(fēng)味，漫長的釀造過程而身價倍增，被譽(yù)為“液體黃金”。

冰酒的發(fā)酵過程是一個復(fù)雜的微生物動態(tài)變化及生化過程，包含了不同酵母屬種此消彼長的變化，研究發(fā)酵不同階段酵母菌的消長規(guī)律，有利于冰酒發(fā)酵過程中的微生物控制，也為研究酵母菌對葡萄酒風(fēng)味的影響提供依據(jù)[2]。冰酒原料的高糖、高酸環(huán)境及其發(fā)酵過程要求的低溫等特殊環(huán)境對發(fā)酵過程酵母動態(tài)變化有重要影響[3]。

我國作為世界少有的冰酒釀造國之一，有關(guān)我國冰酒酵母資源的研究意義重大。本研究通過采用甘肅祁連酒莊冰酒主栽品種貴人香（Italian Riesling）為對象，監(jiān)測冰酒大生產(chǎn)發(fā)酵過程中酵母菌菌群的多樣性和動態(tài)變化。利用WLN營養(yǎng)瓊脂、26S rDNA D1/D2區(qū)域的多態(tài)性和Interdelta序列指紋圖譜分析對發(fā)酵過程中不同階段分離的酵母進(jìn)行分類鑒定，跟蹤商業(yè)酵母在冰酒發(fā)酵過程中的變化及其與野生酵母的競爭狀況，有利于明確商業(yè)酵母是否在嚴(yán)苛的冰酒發(fā)酵過程中取得優(yōu)勢地位，為冰酒發(fā)酵過程中的微生物控制和冰酒風(fēng)味改良與提升提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

于2011年11月從甘肅祁連葡萄酒有限公司葡萄基地采集釀造冰白主栽品種貴人香（糖度35°Bx，總酸8.1g/L），于60kL的圓柱形不銹鋼發(fā)酵罐發(fā)酵釀造冰白葡萄酒，在大生產(chǎn)中分離酵母180株進(jìn)行分類鑒定。

商業(yè)酵母LVCB：荷蘭DSM公司。

1.2 培養(yǎng)基

菌株的分離培養(yǎng)采用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium，YEPD）[2]；菌株的初步形態(tài)分類采用WLN（Wallerstein laboratories nutrient）營養(yǎng)培養(yǎng)基[4]。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離

貴人香葡萄采收后，除梗、破碎、取汁，均勻加入60mg/L的SO2，葡萄汁澄清后，按2×106CFU/mL接入商業(yè)酵母LVCB，控溫12～16℃。在發(fā)酵過程中，分別于接種前、接種后、起酵時、糖消耗1/4、糖消耗2/3、終止發(fā)酵六個時期取樣1mL，用無菌水稀釋至合適梯度，取100μL涂布于YEPD平板上，加入100mg/L氯霉素抑制細(xì)菌生長，28℃倒置培養(yǎng)3d，每個時期共挑取單菌落30個，于20%甘油中-20℃保藏。

1.3.2 WLN培養(yǎng)基聚類分析

將分離到的180株菌，于YEPD培養(yǎng)基活化12h后，接種于WLN培養(yǎng)基上，28℃倒置培養(yǎng)5d，觀察并記錄菌落顏色和形態(tài)，參照PALLMANN C L等[4]中方法進(jìn)行聚類分析，進(jìn)行26S rDNA D1/D2區(qū)序列的分子鑒定補(bǔ)充，對得到的釀酒酵母進(jìn)行Interdelta指紋圖譜分析。

1.3.3 DNA提取

采用石英砂破壁提取法[5]。

1.3.4 26S rDNA D1/D2區(qū)域PCR擴(kuò)增

使用引物NL1（5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′）和NL4（5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′）進(jìn)行26S rRNA D1/D2區(qū)的擴(kuò)增[6]。PCR反應(yīng)體系（50μL體系）：10×PCR buffer 5μL；25mmol/L MgCl23μL；10mmol/L dNTP 1μL；10μmol/L引物各1μL；Taq酶1.5U，l0ng～lμg/μL模版DNA 1μL；最后加雙蒸水定容至50μL。PCR循環(huán)為：95℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min 20s；循環(huán)36次；72℃保溫8min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測后，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行純化和測序分析。

1.3.5 Interdelta序列擴(kuò)增

采用正向引物delta12（5′-TCAACAATGGAATCCCAAC-3′）和反向引物delta21（5′-CATCTTAACACCGTATATGA-3′）進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)[7]。擴(kuò)增體系為50μL：1×PCR buffer；2.5mmol/L MgCl2；0.2mmol/L dNTP；引物δ12和δ21各為0.2mmol/L；Taq酶0.08U；模版DNA（l0ng/L～lμg/μL）；加滅菌雙蒸水定容至50μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃4min（預(yù)變性）；94℃30s（變性），46℃30s（退火），72℃1min 30s（延伸），循環(huán)35次；72℃10min（補(bǔ)充延伸）。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠檢測（電泳時間為2h），之后置于凝膠成像儀內(nèi)拍照。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

將測序得到26S rDNA序列結(jié)果經(jīng)BLAST軟件分析及序列相似性計算。對Interdelta指紋圖譜的帶型進(jìn)行人工讀帶并統(tǒng)計，將特定位置上有DNA條帶的計為1，無DNA條帶的計為0，對釀酒酵母進(jìn)行基因型。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中酵母菌的種類及其數(shù)量變化

冰酒大生產(chǎn)發(fā)酵過程中共分離菌株180株，其中6株由于保存不當(dāng)被污染，剩余174菌株通過WLN營養(yǎng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)后，根據(jù)菌落顏色和形態(tài)的不同，可初步聚為12類（見圖1），參照PALLMANN C L等[4]、楊瑩等[8-9]描述的WLN分類鑒定結(jié)果和26S rDNA D1/D2鑒定表明，所獲酵母菌分屬于9屬10種（見表1）：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）、核果梅奇酵母（Metschnikowia aff.Fructicola）、檸檬形克勒克酵母（Kloeckera apiculata）、嗜高壓有孢漢生酵母（Hanseniaspora osmophila）、發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、耐熱克魯維酵母（Lachancea thermotolerans）、淺白隱球酵母（Cryptococcus albidus）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum），分別占到了分離總菌株的86.21%、0.57%、2.87%、4.60%、1.15%、1.15%、1.15%、0.57%、0.57%、1.15%。其中，非釀酒酵母24株，釀酒酵母150株。菌落類型D（K.apiculata）有D1和D2兩個不同形態(tài)；菌落類型J（H.uvarum）有J1和J2兩個不同形態(tài)。各個時期酵母菌種群分布及其動態(tài)變化見表2。

由表2可知，接種前S.cerevisiae的比例高達(dá)63%，這可能包括酒廠設(shè)備上的常用商業(yè)酵母的及部分野生酵母，同時也包含分屬5屬5種的具有高糖耐受性的非釀酒酵母；接種后，S.cerevisiae的比例已達(dá)到81.5%；隨著發(fā)酵進(jìn)行，發(fā)酵液中酒精含量不斷增加，S.cerevisiae比例逐漸升高達(dá)到90%以上，此時大量非釀酒酵母由于酒精耐受性不夠而大量死亡[10]，而發(fā)酵末期還存在少量高耐酒精孢圓酵母（T.delbrueckii），發(fā)酵畢赤酵母（P.fermentans）。

2.2 發(fā)酵過程中釀酒酵母的菌株變化

從150株釀酒酵母中選取85株Interdelta序列擴(kuò)增后，得到2種基因型分別為已接種的商業(yè)酵母LVCB（Ⅰ）和1種野生酵母（Ⅱ）（見圖2）。發(fā)酵過程中各個時期釀酒酵母各基因型的動態(tài)變化（見表3）。在冰酒大生產(chǎn)發(fā)酵過程中，接種前有66.7%的商業(yè)酵母LVCB存在可能是因?yàn)榫茝S常年使用LVCB釀酒，致使部分商業(yè)酵母LVC殘留于車間地面、釀酒設(shè)備、空氣等。而野生酵母多樣性不豐富，這可能跟冰酒原料高糖、高酸環(huán)境對酵母生長產(chǎn)生的嚴(yán)苛條件有關(guān)。商業(yè)酵母基本主導(dǎo)了整個冰酒發(fā)酵，在發(fā)酵中后期更是成為絕對的發(fā)酵優(yōu)勢菌，但是野生釀酒酵母在發(fā)酵初中期都表現(xiàn)出了競爭的潛力。

圖1 12株酵母在WLN培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of twelve yeast species on WLN medium

表1 大生產(chǎn)發(fā)酵中分離菌株的WLN形態(tài)描述及鑒定Table 1 Morphological descriptions and identification of yeast colonies on WLN medium isolated from industrial fermentation

表2 發(fā)酵各階段酵母菌種類、數(shù)量和比例Table 2 Species,quantity and proportion of yeast during different fermentation stages

表3 釀酒酵母各基因型在發(fā)酵過程中的分布和比例Table 3 Distribution and proportion of S.cerevisiaein genotypes during different fermentation stages

圖2 釀酒酵母的Interdelta圖譜Fig.2 Interdelta sequence of S.cerevisiaein

3 結(jié)論

我國冰酒釀造所用酵母大多為國外引進(jìn)商業(yè)酵母，而有關(guān)商業(yè)酵母能否在嚴(yán)苛的冰酒發(fā)酵過程中取得優(yōu)勢地位且冰酒發(fā)酵過程中酵母菌種群及動態(tài)變化研究甚少。本研究通過對甘肅祁連貴人香冰葡萄酒大生產(chǎn)發(fā)酵過程中酵母菌群的動態(tài)變化研究，分離到的酵母菌分屬9屬10種，除了常見的葡萄酒相關(guān)酵母外[11-13]，還發(fā)現(xiàn)了Metschnikowia aff.Fructicola、Hanseniaspora osmophila、Cryptococcus albidus等不太常見的非釀酒酵母。這些非釀酒酵母的存在是否與冰酒特殊環(huán)境及此地區(qū)地理環(huán)境有關(guān)還需進(jìn)一步的研究。此外，在菌株水平上對S.cerevisiae進(jìn)行區(qū)分，得到接種的商業(yè)酵母及一種野生酵母，并證實(shí)商業(yè)酵母基本主導(dǎo)了整個冰酒發(fā)酵，但是野生釀酒酵母在發(fā)酵初中期都表現(xiàn)出一定的競爭潛力。與其他地區(qū)大量的野生酵母資源相比[14-16]，本實(shí)驗(yàn)分離得到的釀酒酵母少，這可能跟冰酒發(fā)酵的高糖、高酸、低溫環(huán)境及商業(yè)酵母對本土酵母的排擠作用有關(guān)。

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