瞿朝霞，劉 焱，2 *，羅 燦，劉倫倫

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

膠原蛋白是一種具有重要生理功能的不溶性纖維狀蛋白質(zhì)，由糖、甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸等組成，3條α鏈組成三螺旋結(jié)構(gòu)[1-2]。長(zhǎng)期以來(lái)，膠原蛋白主要從豬牛等的皮膚中提取[3-5]。魚鱗、魚皮和魚骨是魚類加工中的副產(chǎn)物，其中含有豐富的膠原蛋白，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)魚類資源沒(méi)有瘋牛病等風(fēng)險(xiǎn)，其生物安全性較高，關(guān)于魚副產(chǎn)物膠原蛋白的提取研究越來(lái)越多[6]。從不同原料中提取得到的膠原蛋白在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上存在差異[7]，膠原蛋白的種類和結(jié)構(gòu)特性決定其功能特性，但目前關(guān)于魚類副產(chǎn)物膠原蛋白的研究?jī)H停留在提取工藝的優(yōu)化層面[8-20]，鮮有關(guān)于從不同副產(chǎn)物中提取得到的膠原蛋白特性差異的研究。該文在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上，采用已有研究報(bào)道的最優(yōu)工藝條件從草魚（Ctenopharyngodon idellus）副產(chǎn)物魚鱗、魚皮和魚骨中提取酸溶性膠原蛋白（acid-soluble collagen，ASC），并對(duì)其熱變性溫度及表征特性進(jìn)行系統(tǒng)的分析比較，以期為今后魚類副產(chǎn)物膠原蛋白資源的開(kāi)發(fā)及膠原蛋白產(chǎn)品的有效應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮草魚魚鱗、魚皮、魚骨：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東之源超市；碳酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、異丙醇、甲醇、溴化鉀、冰乙酸、氯化鈉、冰醋酸、十二烷基硫酸鈉等（均為分析純）、三羥基甲基氨基甲烷（生物試劑）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；丙烯酰胺（電泳級(jí)，純度＞99%）、過(guò)硫酸銨（純度＞99%）、甘油、溴酚蘭、β-巰基乙醇（純度＞99%）、甘氨酸（純度＞99%）、考馬斯亮藍(lán)R-250、四甲基二乙胺（純度≥99%）：北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SHZ-D（Ⅲ）減壓抽濾裝置：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FD-1D-50真空冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；UV-2450紫外吸收光譜儀：島津（香港）有限公司；DYCZ-24DN電泳儀：北京市六一儀器廠；Nicolet6700傅里葉紅外光譜儀：賽默飛世爾科技有限公司；RVA快速黏度分析儀：北京微訊超劑儀器技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 草魚魚鱗、魚皮和魚骨的預(yù)處理

魚鱗→0.1mol/L NaCO3浸泡6h→0.4mol/L HCl脫鈣6h→漂洗→0.1mol/L NaOH脫脂12h→洗凈、備用

魚皮→10%的異丙醇脫脂→0.1 mol/L 氫氧化鈉處理脫雜蛋白及色素→洗凈、備用

魚骨→剁碎→0.1mol/L NaOH 4℃浸泡4h→2.5%NaCl處理6h→4℃條件下用0.5mol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）脫雜蛋白、色素及鈣質(zhì)→4℃下10%異丙醇處理24h脫脂→洗凈、備用

1.3.2 草魚魚鱗、魚皮和魚骨ASC的提取

預(yù)處理后魚鱗、魚皮和魚骨→加0.5mol/L乙酸1∶20（g∶mL）→室溫下振蕩提取12h→紗布過(guò)濾（濾渣續(xù)提12h）→合并提取液（4 000r/min離心20min）→上清液→加5mol/L NaCl（使其濃度為0.9mol/L）→靜置分層（12h）→離心（5 000r/min）20min→回收上浮絮狀物→加0.5mol/L醋酸使其溶解→取清液→加5mol/L NaCl（使其濃度為0.9mol/L）→回收上浮絮狀物→透析（透析袋截留分子質(zhì)量：8 000～14 000u，蒸餾水中透2d，每8h換一次液）→冷凍干燥

1.3.3 草魚魚鱗、魚皮和魚骨ASC的紫外吸收光譜掃描

將5mg凍干的膠原蛋白粉溶于0.5mol/L的乙酸，配成1g/L膠原溶液。用UV-2450紫外分光光度計(jì)，在190～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，高速掃描最大吸收波長(zhǎng)，得紫外光最大吸收波圖。

1.3.4 草魚魚鱗、魚皮和魚骨ASC的SDS-PAGE電泳

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDSPAGE）方法分析膠原蛋白樣品。取5mg膠原蛋白于0.1mol/L乙酸溶液中在4℃溶脹分散，取0.1mL膠原溶液與0.1mL SDS樣品處理液混合后，沸水浴加熱2 min點(diǎn)樣，開(kāi)始電泳[21]。其中分離膠為12%的丙烯酰胺；濃縮膠為5%的丙烯酰胺。染色液為0.25%的考馬斯亮藍(lán)R-250-甲醇溶液（以體積分?jǐn)?shù)為45%的甲醇作為母液來(lái)配制）；脫色液為5%醋酸-7.5%甲醇液（以體積分?jǐn)?shù)為7.5%的甲醇作為母液來(lái)配制）。

1.3.5 草魚魚鱗、魚皮和魚骨ASC的傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）掃描

取凍干的膠原蛋白2mg與適量KBr壓片，置于紅外光譜儀的變溫附件中。掃描范圍為4 000～400cm-1，分辨率為4cm-1。采用儀器的變溫附件和控溫裝置，掃描溫度點(diǎn)為20℃、35℃、60℃、90℃、110℃，每個(gè)溫度點(diǎn)保溫20min，對(duì)前三個(gè)溫度點(diǎn)掃描信號(hào)累加200次。

1.3.6 草魚魚鱗、魚皮和魚骨ASC熱變性溫度測(cè)定

準(zhǔn)確稱取75mg的膠原蛋白凍干品溶于25mL 0.1mol/L乙酸中，用超聲波促進(jìn)完全溶解，將快速黏度計(jì)設(shè)置程序?yàn)?℃/min，初始溫度為室溫23℃，終止溫度為60℃，測(cè)定黏度，按增比黏度值與溫度關(guān)系作折線關(guān)系圖，增比黏度變?yōu)樵瓉?lái)的50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的溫度即為熱變性溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 草魚魚鱗、魚皮和魚骨ASC的感官性狀

將草魚魚鱗、魚皮和魚骨中酸溶性膠原蛋白（ASC）冷凍干燥后觀察其組織形態(tài)、氣味及色澤等感官性狀，草魚魚鱗、魚皮和魚骨ASC都有輕微的刺鼻味，但是其凍干品的組織形態(tài)存在區(qū)別，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 草魚魚鱗、魚皮和魚骨ASC的感官性狀比較Table 1 Sensory properties comparison of acid soluble collagen from grass carp fish scale,skin and bone

由表1可知，3種ASC都存在輕微的刺鼻味，這可能是與原料中存在的腥味物質(zhì)有關(guān)。魚體含有特殊的腥味，在加工過(guò)程中很難去除，在膠原蛋白的提取中未設(shè)計(jì)去腥工藝，腥味物質(zhì)殘留其中，致使膠原成品存在輕微的刺鼻氣味。其在組織形態(tài)和色澤上的區(qū)別可能與其原料所處的環(huán)境有關(guān)。

2.2 草魚魚鱗、魚皮和魚骨ASC的紫外吸收光譜分析

圖1 魚鱗、魚皮和魚骨ASC紫外吸收?qǐng)D譜Fig.1 UV spectra of acid soluble collagen from grass carp fish scale,skin and bone

圖1為草魚魚鱗、魚皮和魚骨酸溶性膠原蛋白的紫外吸收光譜圖。由圖1可知，在波長(zhǎng)220～250nm區(qū)內(nèi)有強(qiáng)吸收峰，說(shuō)明該溶液中存在有共軛不飽和雙鍵結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。在波長(zhǎng)250～290nm內(nèi)有強(qiáng)吸收峰，說(shuō)明該溶液中有含苯環(huán)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。而就蛋白質(zhì)水解溶液而言，脯氨酸、羥脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸5種氨基酸都具有共軛雙鍵的結(jié)構(gòu)，而后三者都是含苯環(huán)的芳香族氨基酸，他們的紫外最大吸收峰分別苯丙氨酸257nm、酪氨酸275nm、色氨酸280nm，其中以色氨酸紫外吸收最為強(qiáng)烈，故常利用色氨酸在280nm處有一個(gè)紫外強(qiáng)吸收峰對(duì)未知蛋白溶液進(jìn)行定性分析[22]。

從圖1可以看出，魚鱗、魚皮和魚骨ASC溶液分別在波長(zhǎng)216nm、225nm、230nm處有一個(gè)尖銳的吸收峰，這與I型膠原蛋白紫外特征吸收峰出現(xiàn)的位置（225nm左右）基本一致。魚皮ASC在波長(zhǎng)190～210nm處有少量弱吸收峰，魚鱗ASC在波長(zhǎng)250～255nm內(nèi)有兩個(gè)弱吸收峰，魚骨酸溶性膠原蛋白在波長(zhǎng)190～220nm位置內(nèi)有大量弱吸收峰，說(shuō)明提取物純度不夠，前者可能是由于魚皮脫脂不夠，后者可能是魚骨脫鈣環(huán)節(jié)中部分鈣離子與膠原蛋白交聯(lián)導(dǎo)致產(chǎn)物不純。3種酸溶性膠原蛋白在280nm處均沒(méi)有吸收峰，說(shuō)明提取液中沒(méi)有色氨酸，與膠原蛋白氨基酸組成一致。

2.3 草魚魚鱗、魚皮和魚骨ASC的SDS-PAGE電泳分析

圖2為草魚魚鱗、魚皮和魚骨中ASC的SDS-PAGE電泳圖譜。

圖2 魚鱗、魚皮和魚骨酸溶性膠原蛋白SDS-PAGE電泳圖譜Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis of acid soluble collagen from grass carp fish scale,skin and bone

膠原蛋白呈三螺旋結(jié)構(gòu)，從哺乳動(dòng)物提取的膠原蛋白三條α肽鏈可能兩條相同，而從魚類中提取的膠原蛋白3條肽鏈可能全不同，其中γ三聚體為三條α肽鏈組成的膠原分子，β二聚體為2條α肽鏈的組成的膠原分子[23]，電泳圖譜中條帶的光密度反映提取物的大致濃度，條帶出現(xiàn)位置與標(biāo)準(zhǔn)蛋白圖譜對(duì)比可看出樣品蛋白質(zhì)的肽鏈組成[24]。由圖2可知，草魚魚鱗、魚皮和魚骨ASC的電泳圖譜都沒(méi)有在γ三聚體和β二聚體位置，3種ASC均有α鏈，草魚魚皮ASC的α鏈位置顯示寬且濃，草魚魚鱗和魚骨ASC的α鏈位置顯示相對(duì)較窄，相比之下，草魚魚骨ASC的α鏈位置顯示更濃一些。3種ASC條帶均沒(méi)有出現(xiàn)其他雜帶，說(shuō)明提取物純度均較高，但是從圖2中未能看出3種ASC在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別。

2.4 草魚魚鱗、魚皮和魚骨ASC的傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析

分別對(duì)草魚魚鱗、魚皮和魚骨ASC進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 草魚魚鱗、魚皮和魚骨ASC傅里葉紅外光譜圖Fig.3 Fourier infrared spectrogram of acid soluble collagen from grass carp fish scale,skin and bone

酰胺A的吸收峰通常出現(xiàn)在3 440～3 400cm-1，其由游離的N-H伸縮振動(dòng)產(chǎn)生，但它以氫鍵形成締合體后，其峰將向低波數(shù)發(fā)生位移。由圖3可以看出，草魚魚鱗、魚皮和魚骨ASC酰胺A帶分別出現(xiàn)在3 313.15cm-1、3 321.14cm-1、3 324.12cm-1處，表明其N-H伸縮均與氫鍵形成了締合體。

在波數(shù)1 700～16 00cm-1處出現(xiàn)了酰胺Ⅰ帶特征吸收峰，是由C=O伸縮振動(dòng)引起的，1 330～1 220cm-1處出現(xiàn)了酰胺Ⅲ帶特征吸收峰，是由C-N伸縮振動(dòng)和N-H彎曲振動(dòng)引起的，這兩個(gè)區(qū)域是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的敏感區(qū)域。魚鱗和魚骨ASC酰胺Ⅰ帶出現(xiàn)在1 654.40cm-1、1 654.40cm-1處，酰胺Ⅱ帶出現(xiàn)在1 549.90cm-1、1 547.61cm-1處，酰胺Ⅲ帶出現(xiàn)在1 239.32cm-1、1 234.40cm-1處，說(shuō)明魚鱗和魚骨ASC的α-螺旋結(jié)構(gòu)保存完整，存在β-折疊結(jié)構(gòu)，魚皮ASC在這3個(gè)區(qū)域都沒(méi)有吸收峰，說(shuō)明魚皮ASC的α-螺旋結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞。3種膠原蛋白都是加入乙酸提取得到的，紅外光譜結(jié)構(gòu)表明乙酸法提取魚鱗和魚骨膠原蛋白時(shí)只水解了其非螺旋區(qū)域，較大程度的保存了膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)，而乙酸法水解魚皮制備膠原蛋白時(shí)破壞了其三螺旋結(jié)構(gòu)，不能再用于醫(yī)用生物材料，但可用于魚皮膠原多肽類產(chǎn)品的生產(chǎn)。

2.5 草魚魚鱗、魚皮和魚骨ASC的熱變性溫度曲線圖分析

熱變性溫度是膠原蛋白三螺旋被破壞時(shí)的溫度，它主要由羥脯氨酸含量決定，一般認(rèn)為水產(chǎn)膠原蛋白熱變性溫度低于哺乳動(dòng)物膠原蛋白。有研究指出，膠原蛋白的熱穩(wěn)定性與羥脯氨酸的含量呈正相關(guān)關(guān)系，含量越高，熱穩(wěn)定性溫度就越高，膠原蛋白穩(wěn)定性也就越強(qiáng)[25]。羥脯氨酸決定熱穩(wěn)定性的本質(zhì)是羥脯氨酸吡咯環(huán)對(duì)膠原的二級(jí)結(jié)構(gòu)的固定化的貢獻(xiàn)和羥脯氨酸的中氫鍵的作用力。膠原蛋白熱穩(wěn)定性可以由膠原溶液的熱變性溫度表達(dá)，通過(guò)熱變性曲線來(lái)反映。膠原蛋白的變性溫度可以通過(guò)增比黏度與溫度的關(guān)系來(lái)確定。從膠原蛋白熱變性溫度曲線上，增比黏度變?yōu)樵瓉?lái)的50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的溫度即為熱變性溫度[26]。圖4為魚鱗、魚皮和魚骨ASC的增比黏度與溫度曲線。

圖4 草魚魚鱗、魚皮和魚骨ASC增比黏度與溫度曲線圖Fig.4 Specific viscosity and temperature curve of acid soluble collagen from grass carp fish scale,skin and bone

從圖4可以看出，草魚魚鱗、魚皮和魚骨ASC的熱變性溫度在31～35℃之間，其中魚骨ASC（34.5℃）＞魚皮ASC（32℃）＞魚鱗ASC（31℃）。這一結(jié)果與許多報(bào)道相似，這可能與魚鱗、魚皮和魚骨在魚體中所處部位的不同有關(guān)。魚鱗和魚皮處于魚體的外層，且魚鱗直接接觸水環(huán)境，所處環(huán)境溫度比魚骨所處環(huán)境魚體低，說(shuō)明膠原蛋白的結(jié)構(gòu)雖然存在遺傳穩(wěn)定性，但其性質(zhì)與存在的組織和所處的環(huán)境密切相關(guān)。

3 結(jié)論

草魚魚鱗、魚皮和魚骨ASC的紫外吸收光譜和電泳圖譜說(shuō)明了在分子構(gòu)型上的差異并不明顯，3種ASC紫外特征吸收峰出現(xiàn)位置與I型膠原蛋白紫外特征吸收峰出現(xiàn)的位置基本一致。電泳圖譜表明，3種ASC的純度均較高。但是經(jīng)過(guò)傅里葉紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)，雖然3種ASC在酰胺A帶的N-H伸縮均與氫鍵形成了締合體，但是酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅲ帶的特征吸收峰表明草魚魚鱗和魚骨ASC的α-螺旋結(jié)構(gòu)保存較完整，魚皮ASC的α-螺旋結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞；3種ASC中，魚鱗ASC對(duì)熱的耐受性低于魚皮ASC和魚骨ASC，魚骨ASC對(duì)熱的耐受性最高，推測(cè)差異產(chǎn)生的原因可能與膠原存在的組織和所處的環(huán)境有關(guān)。從3種ASC在結(jié)構(gòu)完整性和熱穩(wěn)定性上的差異可知，若要采用酸法制備可用于醫(yī)用生物材料的高分子膠原蛋白產(chǎn)品，可選擇魚鱗或魚骨為原料，以魚皮為原料則適合于制備酸溶性膠原多肽類產(chǎn)品。

[1]蔣挺大.膠原與膠原蛋白[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006.

[2]湯克勇.膠原物理與化學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2012.

[3]MONTERO P,GOMEZ M C.Extracting conditions for Mesrim skin collagen affect functional properties of the resulting gelatin[J].Food Sci,2000,65(3):434-438.

[4]MUYONGA J H,COLE C G B,DUODU K G.Characterization of acid soluble collagen from skins of young and adult Nile perch[J].Food Chem,2004,85(1):81-89.

[5]JAMITAH B,HARVINDER K G.Properties of gelatins from skins of fish black tilapia and red tilapia[J].Food Chem,2002,77(1):81-84.

[6]劉曉丹，陳嘉彥.嶄露頭角的魚膠原蛋白[J].明膠科學(xué)與技術(shù)，2010，30（1）：43-45.

[7]李國(guó)輝，危冬發(fā)，蘇彩秀.膠原蛋白理化性質(zhì)的研究[J].江西化工，2011（3）：117-121.

[8]徐海菊，蔡 健，陳江萍.水產(chǎn)膠原蛋白質(zhì)的基本特性及其在食品加工中的應(yīng)用[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（2）：324-327.

[9]劉邦輝，郁二蒙，謝 駿，等.脆肉鯇魚皮和肌肉膠原蛋白的理化特性及其影響因素研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（2）：200-204.

[10]NAGA T,SUZUKI N.Preparation and partial characterization of collagen from paper nautilus outer skin[J].Food Chem,2002,76(2):149-153.

[11]FEMANDEZ M D,MONTERO P,GUILLEN M C.Gel properties of collagens from skins cod (Gadus morhua) and hake (Merluccius merluccius)and their modification by the coenhancers magnesium sulphate,glycerol and transglutaminase[J].Food Chem,2001,74(2):161-167.

[12]李燕妮，曹紅光，倪艷波.國(guó)內(nèi)魚膠原蛋白制品的市場(chǎng)研究[J].云南化工，2008，35（3）：63-65.

[13]吳 緹，陳舜勝.斑點(diǎn)叉尾鮰魚骨制取膠原蛋白和骨粉的試驗(yàn)研究[J].南方水產(chǎn)，2009（3）：36-40.

[14]苑德順，彭英海，黃 海，等.羅非魚魚骨膠原蛋白提取工藝研究[J].齊魯漁業(yè)，2010（6）：14-16.

[15]林 琳，鄭 枉，呂 順，等.有機(jī)酸提取草魚皮膠原蛋白的工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，23（1）：2246-2247.

[16]辛 菲，李 華，羅 星，等.鲅魚皮酸溶性膠原蛋白提取及分子特性的初步研究[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，49（1）：122-126.

[17]喻亞麗，周運(yùn)濤，何力即，等.斑點(diǎn)叉尾鮰魚皮膠原蛋白的理化特征研究[J].食品工業(yè)科技，2013（4）：89-93.

[18]孔繁東，李 躍，祖國(guó)仁，等.低值魚及下腳料的加工與綜合利用[J].中國(guó)釀造，2008，27（24）：21-24.

[19]徐文杰，李俊杰，賈 丹，等.基于近紅外光譜技術(shù)的草魚營(yíng)養(yǎng)成分的分析[J].食品科學(xué)，2013，34（7）：123-128.

[20]連喜軍.魚類膠原蛋白研究進(jìn)展[J].肉類研究，2007（1）：46-49.

[21]沃興德.蛋白質(zhì)電泳與分析[M].北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2009.

[22]張俊生，李純彩，王曉莉.淺談紫外吸收光譜在有機(jī)化學(xué)中的應(yīng)用[J].內(nèi)蒙古石油化工，2010，36（9）：27-28.

[23]SATTO M.Complete primary structure of rainbow trout type I collagen consisting ofα1,α2,α3 beteromtrimers[J].Eur J Biochem,2001,268(10):2817-2827.

[24]郭堯君.蛋白質(zhì)電泳試驗(yàn)技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社，1999.

[25]張俊杰，段 蕊，陳 玲，等.魚皮ASC、PSC 的提取和性質(zhì)比較[J].食品科技，2008（10）：173-177.

[26]鴻巢章二，橋木周久.郭曉風(fēng)，鄒勝祥譯.水產(chǎn)利用化學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1994.