劉寶，范輝華，彭珠清，劉燕，陳存及

（1.福建農林大學 林學院，福建 福州 350002；2.福建省林業(yè)科學研究院，福建 福州 350012）

不同地理種源無患子的分子多態(tài)性分析

劉寶1，范輝華2，彭珠清1，劉燕1，陳存及1

（1.福建農林大學 林學院，福建 福州 350002；2.福建省林業(yè)科學研究院，福建 福州 350012）

利用篩選出的18對相關序列擴增多態(tài)性（SRAP）引物對12個來自印度和中國不同種源的無患子進行SRAP擴增，計算Dice遺傳相似系數后用非加權組平均法（UPGMA）法進行聚類，分析其親緣關系，以便為今后無患子Sapindus mukorossi優(yōu)質種質資源的保存、選育和后續(xù)研究提供參考。試驗結果表明：12個樣本共擴增出253個帶型，其中191條為多態(tài)性條帶，多態(tài)性百分率為75.16%，樣本的平均遺傳相似系數為0.739，顯示出無患子種內的相似度較高，遺傳分化不明顯。聚類分析表明：印度南的種源與其他種源產生較大的遺傳分異，而印度北的種源由于地理緯度與中國國內種源較為相近，因此，和中國國內種源的遺傳距離沒有印度南種源相差那么大，各種源間的遺傳距離與地理距離基本服從正相關的關系。圖2表3參12

植物學；無患子；地理種源；相關序列擴增多態(tài)性（SRAP）；親緣關系；分子多態(tài)性

無患子Sapindus mukorossi主要分布于中國淮河以南各地，印度和日本也有分布，是一種經濟價值很高的樹種，其果可以提取皂苷制作肥皂等清潔用品，同時也能用作生產農藥的原料；其樹形優(yōu)美，可吸收汽車尾氣、二氧化硫等有害氣體，是一種良好的行道樹種；另外，它根系發(fā)達，在水土保持方面也有很大的利用價值。目前，國內未見通過分子手段揭示無患子不同種源之間遺傳差異的研究，國外Mahar等［1］通過提取無患子DNA，采用隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）標記、DAMD（directed amplification of minisatellite region DNA）、簡單重復間序列（inter-simple sequence repeat，ISSR）標記分析了印度5個不同種源地的遺傳多樣性，但在相關序列擴增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）分子標記的運用上還存在著很大的空白。SRAP分子標記技術具有操作方便快捷、預先不用知道DNA序列的優(yōu)點，并已在多種經濟樹種的種質資源研究中得到運用［2-4］。因此，本研究運用SRAP分子標記技術對國內的10個地理種源和印度的2個地理種源為對象進行多態(tài)性和親緣關系的分析，為無患子優(yōu)質種質資源的保存、親緣關系的判斷、育種方案的制定等提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試材料是采于福建省順昌縣無患子種源收集區(qū)的12個種源材料，取3株·種源-1，選擇剛展開的幼葉，用硅膠干燥法保存帶回實驗室，置于-80℃冰箱備用提取DNA。種源涵蓋了中國浙江省、江西省、廣西省和福建省，及印度南北。

表1 無患子種源地理位置Table 1 Geographic positions of Sapindus mukorossi provenances

1.2 總DNA的提取與測定

采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取DNA［5-6］，用核酸蛋白分析儀測定提取的DNA濃度和純度，用電泳法檢測DNA的完整性，放入-20℃下存儲備用。

1.3 PCR擴增、條件優(yōu)化和檢測

SRAP的引物購自上海生工生物工程技術服務有限公司。擴增反應在德國Eppendorf PCR基因擴增儀上進行。采用優(yōu)化后的反應體系，20 μL體積中，含2.0 mmol·L-1Mg2+，0.2 mmol·L-1dNTPs，0.4 mmol·L-1primers，0.5×16.67 nkat TaqDNA酶，50 ng DNA。

SRAP-PCR擴增程序為：94℃預變性5 min；然后94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸1 min共5個循環(huán)；再94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72℃后延伸10 min。PCR產物在質量分數為1%的瓊脂糖凝膠上電泳分離后放入溴化乙錠（EB）中染色，然后用熒光/可見光數字成像分析系統(tǒng)（Alphalmager HP）拍照觀察并保存。

1.4 引物篩選

以印度北和浙江杭州的DNA為模板鏈進行引物篩選，從88對SRAP引物中篩選出擴增條帶清晰、帶較多多態(tài)性較好的引物18對，用于12個無患子樣品的SRAP分析。引物組合擴增情況見表2。

1.5 數據統(tǒng)計和分析

根據SRAP擴增產物相同位置清晰可辨的電泳帶的有無為統(tǒng)計對象，有記為“1”，無記為“0”，在Excel表格上建立0，1矩陣圖，用NTSYS-pc統(tǒng)計分析軟件計算Dice遺傳相似系數，并進行非加權組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）聚類分析。相似性系數=（2×樣品a和b共有的相同位置數）/（a樣品的位置數+b樣品的位置數）。

表2 引物組合擴增情況Table 2 Results of amplification

2 結果和分析

2.1 多態(tài)性分析

從88對SRAP引物中篩選出擴增條帶清晰、帶較多多態(tài)性較好的引物18對（表2），用于12個不同種源無患子樣品的SRAP分析，共擴增出253條清晰可用的條帶，分子量為100～3 000 bp，個別超過3 000 bp（圖1）。其中多態(tài)性條帶191條，占總條帶的75.16%。每對引物擴增出7～18條多態(tài)性譜帶，平均產生14.06條。條帶統(tǒng)計結果表明：對于同一個種源（以印度南為例），不同的引物組合擴增出5（m6e10）～14（m7e5）條條帶，條帶數目不同，分子量不同，說明不同引物組合在DNA模板鏈上的結合位點不同擴增出的片段長短不一，顯示了多態(tài)性。同一對引物（以m6e1為例）對不同種源擴增出的條帶為7（印度南）～11（清流）條，且條帶位點有很大差異，體現(xiàn)了各種源樣本的遺傳差別。此外，在所有引物組合顯示的條帶中，總有1～2個位點上有特別明亮的特征帶型是大部分種源共有的，顯示了種源間的相似性。

圖1 m6e1為引物的擴增電泳圖Figure 1 SRAP map of Sapindus mukorossiprovenance genome amplified with primer pair m6e1

圖2 無患子12個種源地的聚類圖Figure 2 Dendrogram of 12 Sapindus mukorossi provenances

2.2 無患子地理種源間親緣關系的聚類分析

根據SRAP結果計算出Dice遺傳相似系數（表3），可以看出相似性最高的是福建順昌和福建順昌高陽的2個種源，為0.881；最低的是印度南和浙江杭州及印度南和永安，都為0.585。無患子種源間的平均相似系數為0.739，顯示出無患子種源之間遺傳距離較近。運用UPGMA法對12個種源進行聚類分析，得到聚類圖（圖2）。可以得出當相似系數以0.600為界時，印度南和其他種源地區(qū)分開；以0.720為界時，印度北和其他的種源地區(qū)分開；以0.735為界時，區(qū)分出福建漳州龍海和余下的種源；以0.760為界時又將福建清流種源分出來。而再往后，相似系數在0.780以后分為2類，第1組為廣西欽州、福建順昌高陽和福建順昌，第2組為福建南平、福建永安、福建三明、浙江杭州、江西樟樹。第1組中，距離最接近的福建順昌和福建順昌高陽聚為一類，與廣西欽州區(qū)分開來。第2組中，地理位置最接近的福建三明和福建永安聚為一類后，與福建南平在0.810處相聚，然后此三者在0.795處和浙江杭州聚為一類，最終在0.788處和江西樟樹聚為一類。從聚類結果不難看出，印度南種源有明顯的遺傳分異，而印度北因與國內的種源在緯度上較為接近，生長的光照、熱量等條件較接近，因此，分化不太大。國內的種源間的親緣關系也大致和地理距離呈正相關，但廣西欽州、浙江杭州2處種源的親緣關系規(guī)律就和以上趨勢有較大出入。

表3 各種源材料的相似系數Table 3 Similarity coefficient of 12 Sapindus mukorossi provenances

3 討論

3.1 無患子地理種源的遺傳多樣性水平

一部分植物種［4，7-9］使用SRAP標記的材料出現(xiàn)了很高的多態(tài)性，多態(tài)條帶占90%以上，驗證了SRAP標記的高多態(tài)性；還有一部分如甘藍Brassica oleraceavar.capitata［8］，旱芹Apium graveolens［10］的多態(tài)性分別為51.7%，39.0%，則顯示的多態(tài)性較低。而本試驗所研究的無患子不同引物組合擴增結果的平均多態(tài)性為75.2%，多態(tài)性一般。由此可見，SRAP的擴增多態(tài)性在不同種之間是有差異的。另外，根據Wang等［10］對旱芹的研究，在簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）和SRAP對比的情況下，SSR的平均多態(tài)性是49.2%，高于SRAP的39.0%也證明了SRAP標記不是在任何情況下都能呈現(xiàn)最大的多態(tài)性。

在本試驗中，不同引物擴增出的多態(tài)率為50.00%～92.31%，顯示了不同引物組合的多態(tài)性，說明無患子的遺傳多樣性在其DNA不同位置的片段上體現(xiàn)的程度有較大差異，這一點在Kamalesh等［1］對69個無患子材料所用的RAPD（不同引物的多態(tài)性為100%～46%），DAMD（100%～70%），ISSR（100%～60%）標記上也有體現(xiàn)。因此可以對無患子分子標記的引物選擇做更深入的探究。

3.2 無患子地理種源的遺傳相似性的聚類分析

種源間的平均相似系數為0.739，顯示出無患子的種內變異很小，這與Kamalesh等［1］對印度的無患子種源進行多樣性分析得到的結果相符。Kamalesh等推測原因是由于無患子樹為雌雄同株，并主要靠蟲媒傳粉，當植株較大時，因為傳粉昆蟲（主要為蜜蜂Apis）會在同一植株體上來回停留，使得雌雄配子均來自同一植株，造成子代遺傳分異小。

很多研究表明［10-12］遺傳距離與地理距離有一定的正相關性。從聚類圖來看，最初，種源地被很明顯的分為2支，印度南的種源單獨一支。因為印度南的種源是與所有種源地相隔最遠的種源，與其他種源之間的異質性最大，因而產生了最大的遺傳分異。而印度北的種源和印度南的種源相比，印度北種源和國內種源的遺傳距離沒有印度南種源大，除了樹種本身的遺傳特性外，還有可能是印度北種源地和國內種源地的緯度更為接近，如光照、溫度這些對植物生長影響較大的生態(tài)因子差別不大。根據無患子種源地的聚類圖，可將除印度南之外的種源全都歸為一群，而群內的遺傳距離與地理距離基本服從正相關的關系。個別特殊，如漳州龍海和永安的聚類結果可能是歷史上曾發(fā)生過引種或地質變遷等，或者是種源相似系數太接近，以至于微小的試驗誤差就能引起聚類結果的不同。就后一種可能情況而言，在繪制聚類圖時，可以將每對引物擴增得到的結果進行逐步累積，直到聚類關系基本穩(wěn)定。但關于穩(wěn)定的范圍還有待進一步研究確定。

從研究結果看，無患子的種內分化較小，在進行無患子的種質資源保護和繁育時應注意聚集隔離度較高的不同種源地的種源進行繁殖，以獲得更具遺傳多樣性的無患子后代。

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Molecular polymorphic analysis with geographic provenances of Sapindus mukorossi

LIU Bao1，F(xiàn)AN Huihua2，PENG Zhuqing1，LIU Yan1，CHEN Cunji1
（Forestry College，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，F(xiàn)ujian，China；2.Fujian Research Institute of Forestry,Fuzhou 350012，F(xiàn)ujian，China）

To determine reference material for selective breeding ofSapindus mukorossi,genome DNA of 12 accessions,which were collected from different regions of India and China，were amplified with the sequencerelated amplified polymorphism（SRAP）method using 18 primer pairs.Then，the cumulative band data generated from SRAP was used to calculate the Dice genetic similarity coefficient which was analyzed by the Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean（UPGMA）to detect their mutual relationships.Genetic diversity was determined with a cluster analysis.Results showed that 191 of the total 253 generated bands were polymorphic（75.16%）with a mean coefficient of 0.739.The cluster analysis showed that the provenance in southern India had greater genetic diversity than other provenances.Compared to the provenance of southern India，less genetic diversity was noted for provenances of northern India and Chinese provenances where geographic latitudes were similar.Positive relationships occurred between genetic distance and geographic distance in 12 geographic provenances ofS.mukorossi.Overall，the results showed a low level of diversity in this species.［Ch，2 fig.3 tab.12 ref.］

botany；Sapindus mukorossi；geographic provenances；sequence-related amplified polymorphism（SRAP）；relationship；molecular polymorphism

S686；Q943

A

2095-0756（2014）01-0151-05

10.11833/j.issn.2095-0756.2014.01.023

2013-03-05；

2013-06-21

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項（201104100）

劉寶，講師，博士研究生，從事森林培育學研究。E-mail：40511779@qq.com