李建停，馬德順，牛慶元，張晶晶，紀(jì)珍玲

（沈陽大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 沈陽 110044）

細(xì)胞牽引力在細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育過程中具有獨(dú)特的作用［1］，在細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)球蛋白的相互作用和肌動(dòng)蛋白的聚合作用下而產(chǎn)生［2－4］，并通過黏著斑施加給細(xì)胞外基質(zhì)［5－7］.它對(duì)細(xì)胞的伸展、拖曳、移動(dòng)及信號(hào)傳導(dǎo)具有重要影響［8－10］.研究發(fā)現(xiàn)，α－SMA（平滑肌肌動(dòng)蛋白）是細(xì)胞牽引力的重要調(diào)節(jié)因子，它的表達(dá)可調(diào)節(jié)細(xì)胞牽引力的變化［11－12］，α－SMA 表達(dá)水平和細(xì)胞牽引力大小存在正相關(guān)性［13］.細(xì)胞的癌變和轉(zhuǎn)移與牽引力也有關(guān)系，Wottawah等學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞牽引力在腫瘤診斷方面具有重要意義［14］，康奈爾大學(xué)的學(xué)者也發(fā)現(xiàn)在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移前后牽引力有明顯的變化［15］，馬德順等學(xué)者發(fā)現(xiàn)人的干細(xì)胞經(jīng)過分化后牽引力將減?。?6］，不同種類、不同形態(tài)、不同發(fā)育階段的細(xì)胞其牽引力也不同［17－18］.腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的牽引力不同，正常細(xì)胞癌變后牽引力會(huì)發(fā)生變化，有些藥物和因子對(duì)細(xì)胞牽引力具有調(diào)節(jié)作用［19－21］，現(xiàn)在很多學(xué)者采用誘導(dǎo)分化的方法對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)，但誘導(dǎo)分化劑對(duì)于細(xì)胞牽引力的影響還未見報(bào)道.本實(shí)驗(yàn)用肉桂酸做誘導(dǎo)分化劑對(duì)小鼠肺癌細(xì)胞進(jìn)行處理，采用鬼筆環(huán)肽染色技術(shù)和免疫印跡技術(shù)觀察了小鼠肺癌細(xì)胞誘導(dǎo)分化前后細(xì)胞內(nèi)部構(gòu)象和α－SMA蛋白含量變化， 并 用 CTFM （Cell Traction Force Microscopy，即顯微鏡追蹤法測(cè)定細(xì)胞牽引力）法［3］2測(cè)定了小鼠肺癌細(xì)胞分化前后的細(xì)胞牽引力變化，旨在發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)分化對(duì)小鼠肺癌細(xì)胞的力學(xué)特性和細(xì)胞內(nèi)部構(gòu)象及α－SMA的影響［22］.

1 材料與方法

1.1 Lewis肺癌細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)材料

Lewis肺腺癌細(xì)胞株（LLC，來源于C57BL／6小鼠的肺腺癌細(xì)胞）由中科院提供，DMEM（氨基酸和葡萄糖復(fù)配）培養(yǎng)液購(gòu)于Invitrogen公司，犢牛血清購(gòu)于德國(guó)Biochrom公司，抗體及鬼筆環(huán)肽購(gòu)于Sigma公司，肉桂酸購(gòu)于上海江萊生物科技有限公司.所有物品均經(jīng)高壓滅菌.

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1 小鼠肺癌細(xì)胞的培養(yǎng)

取小鼠肺癌細(xì)胞株，放在含10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的FBS（牛胎血清）和200U／mL雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，置于5%體積分?jǐn)?shù)的CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以后每3～4d傳代1次［23－26］，100mL培養(yǎng)瓶傳代為5×105個(gè)／mL［27］.

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組

空白對(duì)照組：用上述培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，添加與實(shí)驗(yàn)組等量的氫氧化鈉做對(duì)照組.

誘導(dǎo)劑實(shí)驗(yàn)組：由于肉桂酸對(duì)肺腺癌細(xì)胞具有誘導(dǎo)分化作用［28］，故選肉桂酸做誘導(dǎo)劑.用等質(zhì)量摩爾濃度氫氧化鈉溶解肉桂酸為鹽，制成終濃度為12mmol／L的原液.使用時(shí)按使用的質(zhì)量摩爾濃度稀釋在培養(yǎng)基（3mmol／L）中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞傳代，待細(xì)胞貼壁后1d加入含誘導(dǎo)劑培養(yǎng)基，隔日換液.

1.3 鬼筆環(huán)肽染色

經(jīng)過7d左右誘導(dǎo)后，分別收集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞在蓋玻片上培養(yǎng)至體積分?jǐn)?shù)達(dá)70%～80%（蓋玻片面積）后取出（約3～5d），用PBS（磷酸鹽緩沖液）輕柔洗滌；3.7%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的甲醛－PEMD固定10min，PBS洗去固定液，略干燥后滴 0.1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的 Triton X－100 處理 10 min，PBS洗滌，加入20mL，5μg／mL鬼筆環(huán)肽染液到清潔載玻片上，將蓋玻片上細(xì)胞樣品反扣其上，避光染色40min，取出后用PBS和蒸餾水沖洗，顯微鏡下觀察.

1.4 免疫印跡技術(shù)檢測(cè)α－SMA蛋白的變化

分別收2mL（約30萬個(gè)細(xì)胞）的誘導(dǎo)分化前后小鼠肺癌細(xì)胞，用含1.5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液（Sigma－Aldrich公司）處理細(xì)胞，制備電泳樣本，用BCA（蛋白定量分析）試劑盒檢測(cè)其濃度，取等量蛋白樣本注入10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的聚丙烯酰胺凝膠，90V恒定電壓電泳，用電轉(zhuǎn)膜儀以70V電壓轉(zhuǎn)膜90min.用5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的奶粉PBS－Tween20緩沖液處理1h，用抗鼠α－SMA特異蛋白為一抗，用過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠免疫球蛋白為二抗，用ECL蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)α－SMA.

1.5 細(xì)胞牽引力測(cè)算

1.5.1 CTFM 技術(shù)

CTFM基本原理是根據(jù)細(xì)胞基質(zhì)彈性表面形變程度來測(cè)算細(xì)胞牽引力的一種技術(shù).其簡(jiǎn)要操作步驟如下：制備相應(yīng)硬度的彈性基質(zhì)，摻入熒光微珠，先用普通光源拍攝細(xì)胞，再用綠色熒光拍攝有細(xì)胞的基質(zhì)圖片，加入2滴氫氧化鈉c（NaOH）＝1mol／L）殺死細(xì)胞后再拍攝一張基質(zhì)圖片，分別進(jìn)行編號(hào)以進(jìn)行分析.

1.5.2 細(xì)胞種植

分別取兩組預(yù)測(cè)細(xì)胞，用胰酶處理后獲得懸浮細(xì)胞，經(jīng)離心棄胰酶溶液后加入新培養(yǎng)液，取50μL細(xì)胞液，約含1 500～2 000個(gè)細(xì)胞，種在彈性基質(zhì)上，待細(xì)胞貼壁后補(bǔ)充3mL培養(yǎng)液，培養(yǎng)6h，測(cè)定細(xì)胞牽引力.

1.5.3 圖像信息的分析處理

用MATLAB 7.0軟件運(yùn)行專用程序?qū)D片進(jìn)行比較分析，測(cè)算出各個(gè)細(xì)胞的牽引力及其相關(guān)參數(shù).將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行分析求出平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差，并用k－s檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)功能對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證.

2 結(jié) 果

2.1 微絲的變化

利用鬼筆環(huán)肽對(duì)小鼠肺癌細(xì)胞誘導(dǎo)分化前后分別進(jìn)行染色觀察，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組的小鼠肺癌細(xì)胞的微絲相比誘導(dǎo)組的細(xì)胞微絲明顯變細(xì)，且分布比較規(guī)則有序；癌細(xì)胞微絲呈現(xiàn)不規(guī)則的分布，處于一種扭曲和包含能量的狀態(tài)，而經(jīng)過誘導(dǎo)分化后能量得到釋放扭曲消失，形態(tài)和分布接近正常細(xì)胞（見圖1）.

圖1 小鼠肺癌細(xì)胞誘導(dǎo)分化前后微絲的變化Fig.1 The microfilament changes of themice's lung carcinoma cells before and after induced differentiation

2.2 免疫印跡法檢測(cè)α－SMA蛋白的變化

經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，小鼠肺癌細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后α－SMA蛋白含量明顯高于分化前的細(xì)胞，見圖2.

圖2 小鼠肺癌細(xì)胞誘導(dǎo)分化前后α－SMA蛋白表達(dá)變化Fig.2 Theα－SMA protein changes of the mice's lung carcinomacells before and after induced differentiation

2.3 細(xì)胞牽引力的變化

采用了CTFM法對(duì)小鼠肺癌細(xì)胞誘導(dǎo)分化前后的細(xì)胞及正常細(xì)胞牽引力進(jìn)行測(cè)量.測(cè)得小鼠肺癌細(xì)胞分化后牽引力變大，平均值由281Pa增加到550Pa，增加大約一倍，經(jīng)測(cè)算細(xì)胞投影表面積平均值由695μm2增加到955μm2，增加大約37%（見圖3）.細(xì)胞的最大牽引力由1.2kPa增加為1.7kPa（見圖4）.

圖3 小鼠肺癌細(xì)胞誘導(dǎo)分化前后細(xì)胞牽引力和投影面積的比較（n＝30，P＜0.05）Fig.3 The comparison of cell traction force and projected area of mice's lung carcinoma cells before and after induced differentiation（n＝30，P＜0.05）

圖4 小鼠肺癌細(xì)胞誘導(dǎo)分化前后牽引力的分布變化Fig.4 The changes of distribution on the cell traction force of mice’s lung carcinoma cells before and after induced differentiation

3 討 論

細(xì)胞牽引力是由細(xì)胞內(nèi)的肌動(dòng)球蛋白的相互作用和肌動(dòng)蛋白的聚合作用產(chǎn)生的應(yīng)力，而且與細(xì)胞的狀態(tài)及蛋白組成密切相關(guān)［29］.當(dāng)小鼠肺癌細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化以后，細(xì)胞內(nèi)部的微絲骨架、形態(tài)、體積、α－SMA蛋白及細(xì)胞牽引力都恢復(fù)接近正常細(xì)胞狀態(tài).這一現(xiàn)象說明癌細(xì)胞的微絲骨架是扭曲的，即構(gòu)成微絲、微管和中間纖維的蛋白的收縮程度與正常細(xì)胞是不同的，而這種狀態(tài)直接影響細(xì)胞的外在形態(tài)，使癌細(xì)胞形成一個(gè)新的張力平衡，然而經(jīng)過誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞的內(nèi)部構(gòu)造逐步向正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變，使細(xì)胞的微絲構(gòu)像趨于正常；小鼠肺癌細(xì)胞的α－SMA蛋白和細(xì)胞牽引力也隨著分化而改變，α－SMA蛋白含量變化與細(xì)胞牽引力的變化趨勢(shì)相吻合，說明平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)影響了細(xì)胞牽引力，和此前學(xué)者研究的小鼠髕腱干細(xì)胞得出的α－SMA蛋白減弱是導(dǎo)致細(xì)胞牽引力減弱的原因的結(jié)論相符，也驗(yàn)證了α－SMA蛋白的表達(dá)和細(xì)胞牽引力存在線性關(guān)系，而α－SMA蛋白含量變化與細(xì)胞微絲及形態(tài)的關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究.小鼠癌細(xì)胞分化后細(xì)胞牽引力的變化趨勢(shì)與人的癌細(xì)胞變化趨勢(shì)相反［30］這是一個(gè)非常有趣的現(xiàn)象，不同物種的細(xì)胞癌變后，細(xì)胞形態(tài)和部分蛋白的表達(dá)變化趨勢(shì)都是有差異的甚至是相反的.

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