馬海林　李繼榮　盧保紅　郭盛　張璐

摘 要：玉米單倍體技術(shù)可以大大縮短選育玉米自交系的代數(shù)，加速種質(zhì)資源改良、創(chuàng)新與利用周期，為育種目標(biāo)的快速實現(xiàn)提供可能。玉米單倍體育種技術(shù)是未來玉米育種中的核心技術(shù)，各個環(huán)節(jié)的優(yōu)化是提高該技術(shù)效率的主要途徑。本論文的主要目的是向育種研究人員系統(tǒng)介紹玉米單倍體技術(shù)的概念、發(fā)展過程、基本流程、環(huán)節(jié)優(yōu)化及其在玉米育種中的應(yīng)用情況，增進(jìn)科技工作者對玉米單倍體育種技術(shù)的全面認(rèn)識與了解，促進(jìn)該技術(shù)在玉米育種中的高效利用。

關(guān)鍵詞：玉米單倍體技術(shù)；誘導(dǎo)；優(yōu)化

中圖分類號：S513 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 論文編號：2014-0050

0 引言

玉米單倍體育種技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種快速獲得玉米自交系的先進(jìn)技術(shù)，該技術(shù)可以使玉米自交系純化代數(shù)由原來的6～7代縮短為2～3代，大大加速了改良利用創(chuàng)新種質(zhì)的時間，為育種目標(biāo)的快速實現(xiàn)提供可能。利用該技術(shù)可快速獲得自交系，縮短育種周期，加快育種進(jìn)程。目前該技術(shù)在大型跨國玉米種業(yè)公司（杜邦先鋒、孟山都、先正達(dá)、利馬格蘭、KWS等）的玉米育種環(huán)節(jié)中已大規(guī)模應(yīng)用，成為選育玉米自交系的主要方法。玉米單倍體技術(shù)是一項系統(tǒng)化、規(guī)?；c工程化的技術(shù)，涉及很多技術(shù)環(huán)節(jié)，目前在國內(nèi)該技術(shù)還處在研究發(fā)展當(dāng)中，還有很多需要完善的地方，目前主要還是以規(guī)模換效率，以小課題組為單位的研究形式難以成功利用該技術(shù)，如何應(yīng)變值得思考。隨著玉米商業(yè)化競爭加劇與國家、地方政府政策支持重點的轉(zhuǎn)移，中國的玉米育種研究者正面臨前所未有的考驗，玉米生產(chǎn)與玉米育種目標(biāo)的改變對種質(zhì)資源的創(chuàng)新利用研究提出了新的要求，創(chuàng)新效率急需提升，玉米單倍體育種技術(shù)正迎來前所未有的機(jī)遇。盡管目前國內(nèi)玉米單倍體技術(shù)的研究報道較多，但多數(shù)只是集中在具體某一方面研究報道。當(dāng)前國內(nèi)玉米育種一線工作者對玉米單倍體技術(shù)的各個技術(shù)環(huán)節(jié)缺乏系統(tǒng)的了解與全面的認(rèn)識，很有必要對這方面的知識進(jìn)行普及，加強對該技術(shù)的宣傳與推廣，明確該技術(shù)體系中各環(huán)節(jié)的研究方向，增加對該技術(shù)體系的研究力度，提升中國種業(yè)在玉米商業(yè)化育種中的競爭能力與地位。

1 玉米單倍體相關(guān)技術(shù)研究概況

單倍體一般是指只具有配子染色體的細(xì)胞或個體，Bergner1921年在曼陀羅中發(fā)現(xiàn)了第1個單倍體植株，后人相繼在煙草（Nicotiana tabacum），小麥（Triticum aestivum）等多種作物中發(fā)現(xiàn)了自發(fā)單倍體[1]。目前，全世界有250多個作物和物種應(yīng)用了雙單倍體育種[2]。據(jù)Randolph[3]的文章提到Stadler是玉米中最早描述單倍體的研究者。但直到1947年Chase[4]將選育的優(yōu)良純合的雙單倍體系（DH系）用于商業(yè)化雜交種，玉米單倍體育種技術(shù)才有了實質(zhì)性的發(fā)展。1951年Chase[5]報道了單倍體育種技術(shù)在玉米育種中的應(yīng)用，并育成了世界上第1個有推廣價值的DH系雙雜交種DeKalb640，該雜交種是用3個DH系和1個骨干自交系育成的雙雜交種，耐密性好，在美國東部、法國南部與意大利北部等地區(qū)得到了大面積推廣。Chase還是第1個實現(xiàn)玉米單倍體自花授精的科學(xué)家[2]。自然界中玉米自發(fā)產(chǎn)生單倍體的頻率極低，僅為0.05%[6]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足商業(yè)化育種的需求。1941年Charles R.Burnham博士的研究生Coe從Northrup King種子公司得到1份具有紅葉耳、白色胚乳和紫色糊粉層硬粒型獨特遺傳性狀的晚熟墨西哥食用玉米品系作色素研究，1950年Coe[7]把它命名為Stock 6。經(jīng)研究后發(fā)現(xiàn)Stock 6自交后會出現(xiàn)2.52%單倍體。隨后他們又將一些色素標(biāo)記（R1-nj等）導(dǎo)入Stock6中，Sarkar[8]將其運用到單倍體子粒的鑒定中，單倍體育種技術(shù)的相關(guān)研究也由此拉開了序幕。國外相繼選育出WS14[9]、MHI[10]、RWS[11]和EMK[12]等一批優(yōu)良孤雌生殖誘導(dǎo)系。國內(nèi)這方面的工作起步較晚，但經(jīng)過堅持不懈的研究，也取得了較大的進(jìn)展，在誘導(dǎo)系選育方面先后選育出‘農(nóng)大高誘一號[13]、‘吉高誘3號[14]、‘H01-H05[15]，‘農(nóng)大高誘2-5號等[16]。目前玉米單倍體育種技術(shù)主要是利用植物孤雌生殖誘導(dǎo)系得到單倍體。經(jīng)過孤雌生殖得到的自交系，純度高，遺傳穩(wěn)定，配合力高，雜種優(yōu)勢強，在育種中有很大的實用價值和廣闊的應(yīng)用前景[17]。

單倍體的產(chǎn)生是單倍體技術(shù)中的核心環(huán)節(jié)，其中生物誘導(dǎo)是產(chǎn)生單倍體的最簡易的方法之一。生物誘導(dǎo)產(chǎn)生活體單倍體途徑有3種類型：品種間雜交可產(chǎn)生單倍體；不定配子體基因誘導(dǎo)可產(chǎn)生孤雄生殖單倍體；孤雌生殖誘導(dǎo)系雜交誘導(dǎo)產(chǎn)生孤雌生殖單倍體。目前成功利用的是孤雌生殖誘導(dǎo)系雜交產(chǎn)生單倍體的方法。用孤雌生殖誘導(dǎo)系花粉給其他玉米材料做雜交時，能夠誘導(dǎo)相應(yīng)的母本產(chǎn)生單倍體，產(chǎn)生的單倍體只包含母本的半套染色體組，很少含父本的染色體組。該方法由于操作簡單，單倍體發(fā)生頻率高，后發(fā)展為獲得玉米單倍體的主要途徑，成為玉米單倍體育種技術(shù)中的重要環(huán)節(jié)。狹義的玉米單倍體技術(shù)僅包含單倍體的獲得與加倍過程，以得到純合的玉米自交系為最終目標(biāo)；廣義的玉米單倍體技術(shù)應(yīng)包含從組配材料到獲得優(yōu)良自交系過程中的各個環(huán)節(jié)及單倍體技術(shù)本身研究中的一些技術(shù)環(huán)節(jié)，以獲得優(yōu)良玉米組合為最終目標(biāo)。

2 玉米單倍體技術(shù)的基本流程

玉米單倍體技術(shù)的基本流程包括4個重要環(huán)節(jié)：育種基礎(chǔ)材料種質(zhì)分析與組配、單倍體的誘導(dǎo)與鑒別、單倍體加倍、自交系篩選與測配。

種質(zhì)分析與組配是根據(jù)育種目標(biāo)對需要改良的種質(zhì)資源與含有目標(biāo)基因的種質(zhì)進(jìn)行分析與組配，根據(jù)遺傳規(guī)律采用常規(guī)育種方法組配成基礎(chǔ)的選系群體。選系群體可以是低代群體也可以是自交或回交兩到三代的高代群體。

單倍體的誘導(dǎo)與鑒別：主要指單倍體的誘導(dǎo)與單倍體籽粒的挑選程序。利用孤雌生殖誘導(dǎo)系做父本誘導(dǎo)上述選系群體，進(jìn)一步通過遺傳標(biāo)記或是其他方法鑒別出單倍體籽粒。選系群體的誘導(dǎo)規(guī)模要根據(jù)群體內(nèi)材料遺傳關(guān)系的遠(yuǎn)近來確定，血緣關(guān)系較近的用小規(guī)模，較遠(yuǎn)則需擴(kuò)大誘導(dǎo)規(guī)模才有可能獲得目標(biāo)純系；同時誘導(dǎo)系誘導(dǎo)率高低對誘導(dǎo)的規(guī)模影響也很大，要結(jié)合這兩方面因素及預(yù)期獲得目標(biāo)自交系的數(shù)量做統(tǒng)籌安排。單倍體籽粒的挑選目前國內(nèi)主要還是依據(jù)遺傳標(biāo)記的方法篩選出單倍體籽粒，另外也可結(jié)合單倍體的田間表現(xiàn)進(jìn)行進(jìn)一步的鑒別。

單倍體加倍可分為自然加倍與化學(xué)加倍。單倍體籽粒經(jīng)過加倍后才能獲得正常的二倍體純合自交系。對于自然加倍率高的群體，采用直接種植單倍體籽粒，單倍體植株自發(fā)加倍后變成可育株，將散粉株自交就能獲得自交系，但對于一些自然加倍率低的群體則必須采取化學(xué)加倍的方法才有可能獲得盡可能多的目標(biāo)純系。

自交系篩選與測配：通過加倍后獲得自交系要再加一代才能得到足夠多的自交系種子，在加代過程中可根據(jù)自交系的植株及果穗性狀淘汰掉大部分不符合育種目標(biāo)的自交系，獲得的純系最好再經(jīng)過1年多點或是多年多點的綜合表現(xiàn)進(jìn)行篩選才有可能獲得優(yōu)良的目標(biāo)純系；另外也可通過分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)對自交系進(jìn)行目標(biāo)基因篩選直接獲得目標(biāo)純系。得到的目標(biāo)純系通過進(jìn)一步的配合力測試得到優(yōu)良組合。

3 玉米單倍體技術(shù)的優(yōu)化

目前國內(nèi)單倍體技術(shù)還處在發(fā)展當(dāng)中，效率較低，許多技術(shù)環(huán)節(jié)還有待改善與提高。玉米單倍體技術(shù)優(yōu)化的根本目標(biāo)是提高獲得優(yōu)良自交系的效率。主要包括以下幾方面內(nèi)容的優(yōu)化：單倍體誘導(dǎo)，單倍體鑒別，單倍體加倍，DH系管理。

3.1 單倍體誘導(dǎo)環(huán)節(jié)的優(yōu)化

主要集中在以下幾個方面：誘導(dǎo)系，母本材料，誘導(dǎo)地點，誘導(dǎo)時間。誘導(dǎo)系的誘導(dǎo)率、遺傳標(biāo)記、農(nóng)藝性狀是優(yōu)化重點。主要是用遺傳改良的方法提高誘導(dǎo)率，目前國內(nèi)外較好的誘導(dǎo)系平均誘導(dǎo)率在10%左右；遺傳標(biāo)記是人工快速挑選單倍體籽粒的重要依據(jù)，所以加強誘導(dǎo)系中遺傳標(biāo)記的選擇有利于快速準(zhǔn)確地挑出單倍體籽粒。農(nóng)藝性狀改良主要是提高誘導(dǎo)系的散粉性與抗倒性，實踐表明多數(shù)莖桿攜帶紫色標(biāo)記基因的誘導(dǎo)系抗倒性較差，不易改良。另外多數(shù)誘導(dǎo)系本身雌雄不調(diào)，結(jié)實性差，目前這些性狀用常規(guī)育種的方法改良效果還不是很理想，可能誘導(dǎo)率性狀與這些性狀有關(guān)聯(lián)。母本材料的優(yōu)化主要是根據(jù)母本材料的遺傳特性制定誘導(dǎo)計劃，以便獲得足夠多的單倍體。當(dāng)母本材料群體內(nèi)的遺傳差異小時可用較小的群體規(guī)模，但群體內(nèi)遺傳差異較遠(yuǎn)時則要考慮放大誘導(dǎo)規(guī)模。誘導(dǎo)地點、時間的選擇可以改善誘導(dǎo)系與母本材料的自然與栽培條件，減少病、蟲、害、光照、水肥等因素對誘導(dǎo)系與母本材料正常生長的影響。另外單倍體誘導(dǎo)系一般生育期都較短，需要通過錯期播種技術(shù)調(diào)節(jié)花期，同時為保證雜交的質(zhì)量，母本材料均要嚴(yán)格套袋隔離，采用隔離區(qū)制種方式誘導(dǎo)時也要對隔離條件做嚴(yán)格要求。

3.2 單倍體鑒別程序的優(yōu)化

單倍體鑒別主要是指從誘導(dǎo)后果穗籽粒中挑選出單倍體籽粒，目前主要還是依據(jù)玉米籽粒胚乳頂部糊粉層的紫色標(biāo)記來鑒別。經(jīng)單倍體誘導(dǎo)系誘導(dǎo)雜交后一般的二倍體籽粒表現(xiàn)胚乳頂部糊粉層與胚芽呈紫色，該性狀由R1-nj基因所控制，在籽粒中表達(dá)較為穩(wěn)定。該環(huán)節(jié)的優(yōu)化主要是將鑒別過程分三步進(jìn)行：第一步是粗篩選，就是將單倍體由工作人員從雜交籽粒中初步挑選出來，這一步建議在果穗上進(jìn)行，因籽粒在果穗上胚面均向穗尖方向排列，通過比較鑒別很容易發(fā)現(xiàn)胚芽無色的單倍體籽粒，但如果遇到不好脫粒的果穗則需先用機(jī)器將籽粒脫下后再挑選以加快挑選效率。第二步是精細(xì)挑選，就是對挑出的單倍體籽粒由較專業(yè)的工作者再進(jìn)行一次嚴(yán)格挑選，剔除掉那些可疑單倍體籽粒。第三步是單倍體的田間鑒別，一般來說顏色標(biāo)記比較明顯的單倍體籽粒經(jīng)過前面兩個步驟后假單倍體所占的比例基本能控制在5%以下，單倍體植株在田間一般表現(xiàn)比較弱小，二倍體植株與雜株表現(xiàn)強壯高大，據(jù)此特征可以在田間直接去除假單倍體。另外單倍體鑒別程序的優(yōu)化還體現(xiàn)在依據(jù)籽粒的其他特征性狀進(jìn)行單倍體鑒別的研究，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)陳紹江課題組已研制出利用油份花粉直感效應(yīng)鑒別玉米單倍體的自動化篩選機(jī)器。

3.3 單倍體加倍優(yōu)化

單倍體加倍優(yōu)化主要有以下幾方面內(nèi)容：第一是根據(jù)群體的特性選擇合適的加倍方法。目前國內(nèi)主要加倍方法是自然加倍法和以秋水仙素處理為主的化學(xué)加倍法。對于自然加倍率高的群體采用自然加倍的方法最為適宜，對于那些自然加倍率低的群體則需采用化學(xué)加倍，以提高獲得純系的效率。第二是選擇合適地點種植單倍體并加強田間栽培管理。單倍體植株由于生長勢較弱，對環(huán)境條件比較敏感，特別是散粉期間，最好選擇光照充足，陰雨天氣少、水肥條件較好的地點種植，土壤條件以沙性土壤為好。第三是授粉方式優(yōu)化。多數(shù)發(fā)生自然加倍的單倍體植株可散粉的花藥只有少數(shù)的幾個，且雌雄不協(xié)調(diào)，多數(shù)雌穗授粉前需要剪去苞葉才能露出花絲。授粉前單倍體雌穗需要套袋隔離，單倍體雄穗不需套袋。于雄穗開花當(dāng)天將花粉輕輕抖在干凈的雌穗袋上，再小心均勻地轉(zhuǎn)移到花絲上，對于較嫩的花絲剪苞葉時應(yīng)盡量避免剪到花絲，一些花粉沒有自然散出的飽滿花藥需用小剪刀剪掉花藥尾部一小部分，將花粉抖出后進(jìn)行授粉操作。授粉后當(dāng)天下午或第二天如有時間要檢查已授粉株是否還有花粉，如有則最好進(jìn)行二次授粉，以提高結(jié)實率。每次授粉后要對雙手及授粉器具用酒精進(jìn)行消毒，避免花粉污染。進(jìn)行化學(xué)加倍后的單倍體植株如果散粉量相對較大，雄穗有時也需要套袋隔離后取粉，以避免花粉污染?；瘜W(xué)加倍方法國內(nèi)目前以中國農(nóng)業(yè)大學(xué)的芽苗法較為理想（私人通訊），加倍效率能達(dá)到30%以上。

3.4 DH系管理優(yōu)化

經(jīng)過單倍加倍后獲得的自交系，又稱為DH（Doubled haploid）系，由于加倍當(dāng)代種子量很少，還需擴(kuò)繁一代才能有足夠的種子量進(jìn)行下一步的研究，同時擴(kuò)繁過程還可根據(jù)整齊度等田間農(nóng)藝性狀表現(xiàn)淘汰雜合的假自交系。由于加倍后得到的自交系僅經(jīng)過自然選擇與淘汰，自交系數(shù)量較大時還不適宜直接用于配合力測試。DH系管理優(yōu)化主要是通過自交系的多點表現(xiàn)篩選符合育種目標(biāo)的優(yōu)良自交系，淘汰大部分不符合育種目標(biāo)的自交系，應(yīng)根據(jù)不同的育種目標(biāo)制定相應(yīng)的篩選策略，將來也有可能利用分子標(biāo)記的手段來直接對DH系進(jìn)行篩選直接獲得符合育種目標(biāo)的自交系。經(jīng)過篩選后得到的優(yōu)良自交系就可以進(jìn)行下一步配合力的測定程序。

4 單倍體技術(shù)在玉米育種中的應(yīng)用

4.1 在種質(zhì)資源創(chuàng)新利用中的重要價值

長期以來中國玉米種質(zhì)資源引進(jìn)的多，能利用的少，主要原因是常規(guī)育種技術(shù)育種周期長，可預(yù)見性差，導(dǎo)致種質(zhì)資源的利用遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于生產(chǎn)需求。玉米單倍體技術(shù)可以快速獲得并篩選出符合育種目標(biāo)的自交系，大大縮短了種質(zhì)資源的利用周期，進(jìn)而快速選育出符合生產(chǎn)需求的優(yōu)良品種。隨著玉米商業(yè)化育種的競爭加劇，玉米單倍體技術(shù)越來越顯示出優(yōu)越性，可以預(yù)見玉米單倍體技術(shù)是未來育、繁、推一體化大型種子公司獲得玉米自交系，選育玉米新品種的主要技術(shù)手段。

4.2 自交系純化

玉米自交系種子在使用過程中會由于各種自然或人工原因發(fā)生退化，使雜交種的整齊度與雜種優(yōu)勢減弱，商品性下降。所以對于一個優(yōu)良品種而言，親本自交系的提純復(fù)壯是一個很重要的工作程序。利用玉米單倍體技術(shù)可以快速選育到與原親本自交系接近的純系。

4.3 快速穩(wěn)定優(yōu)良基因，淘汰不良性狀

由于單倍體技術(shù)選育自交系的過程中種子經(jīng)過一個由二倍體到單倍體再到二倍體世代的轉(zhuǎn)換，在單倍體世代中種子的各種性狀均可得以表現(xiàn)，多數(shù)不良基因控制的性狀會導(dǎo)致單倍體種子和植株生活能力下降、高度不育，進(jìn)而實現(xiàn)自然淘汰。同時由于單倍體技術(shù)只經(jīng)過兩代就可得到純系，通過對純系表型或基因的篩選鑒定就可得直接獲得理想的目標(biāo)自交系。

5 展望

目前玉米單倍技術(shù)研究主要集中在單倍體誘導(dǎo)機(jī)理研究[18-28]，誘導(dǎo)系選育[29-32]，單倍體鑒別[33-36]、加倍[37-39]，DH系的篩選與測配體系研究[40-42]等方面。玉米單倍體技術(shù)的效率正在逐步提升，但該技術(shù)涉及的技術(shù)環(huán)節(jié)較多，是一項系統(tǒng)化、工程化的綜合技術(shù)，人力、物力投入均較大，并不適合規(guī)模小的課題組，更適合于規(guī)模較大有實力的育、繁、推一體化的種業(yè)公司使用，對中國的種業(yè)公司而言應(yīng)加強單倍體技術(shù)的集成與優(yōu)化創(chuàng)新等方面研究。玉米單倍體相關(guān)技術(shù)的研究促進(jìn)了玉米單倍體技術(shù)在育種中的廣泛應(yīng)用，系統(tǒng)了解該技術(shù)流程的各個環(huán)節(jié)有利于育種科研人員對該技術(shù)進(jìn)行集成創(chuàng)新應(yīng)用。隨著國內(nèi)玉米種植模式與收獲方式的轉(zhuǎn)變，國內(nèi)玉米育種的種質(zhì)資源面臨更新?lián)Q代，創(chuàng)新與改良發(fā)展利用新的種質(zhì)資源給單倍體技術(shù)帶來新的機(jī)遇。玉米單倍體育種技術(shù)與其他玉米常規(guī)育種選系技術(shù)相比，在自交系純化方面具有不可替代的優(yōu)越性。但在群體組建與改良前期，其他的育種方法例如回交育種與群體輪回選擇等方法還是必不可少的。所以今后的育種技術(shù)革新必然是常規(guī)育種技術(shù)與單倍體育種技術(shù)的有機(jī)結(jié)合。另外隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)必將融入玉米單倍體技術(shù)體系，成為目標(biāo)基因?qū)牖蛐誀罡牧贾袡z測、跟蹤靶基因的最有效工具。

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