王玉　賈錦山　張娜娜　趙蘭勇

摘 要：為了找到一種方便、快捷且經濟高效的玫瑰葉片基因組DNA提取方法，為玫瑰后期的分子生物學研究奠定良好基礎，以不同品種的玫瑰幼嫩葉片為材料，分別利用CTAB法、SDS法、改良CTAB法、試劑盒法4種方法提取玫瑰基因組DNA，經過瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光光度法對所提DNA的質量和產量進行檢測比較。結果表明：4種方法均可從玫瑰葉片中提取到DNA，改良CTAB法作為對常規(guī)方法的改進，在保證經濟實用的前提下提取到的DNA質量最好，濃度最高；而試劑盒法作為一種快速提取植物基因組DNA的新興方法，雖然產量略低，費用略高，但操作步驟簡單，耗時短，毒害小，高效快捷。各實驗室可根據(jù)實際情況選擇適宜的方法。

關鍵詞：玫瑰；DNA提??；CTAB法；SDS法；改良CTAB法；試劑盒法

中圖分類號：S688.9 文獻標志碼：A 論文編號：2014-0054

0 引言

DNA作為生物遺傳信息的載體，是重要的生物信息分子。提取高質量的DNA分子是對植物基因組進行分子生物學如分子標記輔助育種、圖譜構建、基因定位與克隆、遺傳轉化和遺傳多樣性分析[1-2]等研究的重要基礎。因此，能否快速且高質量的提取到植物基因組DNA將直接關系到整個試驗的成敗。目前，國內外對此方面的研究都已有不少。常用的DNA提取方法有十六烷基三乙基溴化銨（CTAB）法[3-5]、十二烷基硫酸鈉（SDS）法[6-9]、高鹽低pH法[10-12]、尿素法[13-15]、試劑盒提取DNA法[16-17]、熱解法、氯苯法等。不同的植物材料要選擇不同的提取方法，有的還要在傳統(tǒng)的方法上加以改進。如趙志常等[3]利用改良的CTAB法提取番石榴的基因組DNA并對其進行SCoT-PCR擴增，濃度質量均符合試驗要求；盧東柏等[9]利用改良后的SDS法提取棉花的基因組DNA，解決了棉花DNA提取質量不高且易褐變的問題；邵峰等[10]通過對CTAB法，SDS法和高鹽低pH法3種方法的對比發(fā)現(xiàn)高鹽低pH法最適合紫色辣椒基因組DNA的提??；而劉順枝等[15]通過試驗對比得出尿素法更適合超積累生態(tài)型和非超積累生態(tài)型的東南景天DNA的提??；梁玉琴等[16]則利用試劑盒法提取到了質量高、雜質少的柿屬植物DNA，并簡化了傳統(tǒng)方法的操作步驟，縮短用時，降低毒害。

因目前尚無對玫瑰基因組DNA提取方法的比較研究，所以筆者以干燥的玫瑰幼嫩葉片為材料，采用4種DNA提取方法——CTAB法、SDS法、改良CTAB法、試劑盒法分別提取其基因組DNA，分析比較所提取到的基因組DNA質量與效率，以期找到一種方便、快捷且高效經濟的玫瑰葉片基因組DNA提取方法，為玫瑰后期的分子生物學研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

研究田間試驗于2013年在山東農業(yè)大學林學試驗站進行，室內試驗在山東農業(yè)大學花卉研究所進行。

1.2 供試材料

1.2.1 材料來源 試驗所用玫瑰材料共選取3個品種15株，3個品種分別為‘紫枝玫瑰、‘北京單白和‘唐白，全部取自山東農業(yè)大學玫瑰種質資源圃。采集新鮮、無病蟲害的玫瑰幼嫩葉片，以塑封袋分裝后加入硅膠顆粒吸收葉片水分，待葉片完全干燥后放于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 試驗藥劑 CTAB提取緩沖液（1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris-HCl，2%CTAB，pH 8.0）；SDS細胞提取液（500 mmol/L NaCl，50 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L β-巰基乙醇，1.5%SDS，pH 8.0）；改良2×CTAB提取緩沖液（1 mol/L Tris-HCl，0.5 mol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，2%CTAB，pH 8.0）；Tris-飽和酚；氯仿-異戊醇（V：V=24：1）；β-巰基乙醇；PVP；異丙醇；5 mol/L KAc；氯仿；70%乙醇；無水乙醇；RNaseA（5 mg/mL）；TE緩沖液；1×TAE溶液；6×loading buffer等。

1.3 4種方法提取玫瑰葉片基因組DNA

1.3.1 CTAB法提取DNA 具體操作過程和步驟參考韓玉杰等[18]的試驗方法并進行改進。具體方法如下：（1）稱取200 mg玫瑰干葉，在液氮中研磨成粉末狀。（2）將粉末轉移至1.5 mL離心管中，加入600 ?L預熱的CTAB提取緩沖液，混勻后65℃水浴保溫20 min。（3）取出離心管，加入等體積的氯仿-異戊醇，充分顛倒混勻。（4）12000 r/min離心10 min，轉移上清液至新管中。（5）重復（3）、（4）步驟1次。（6）吸取上清液于新管中，加入0.6 V異丙醇，輕輕混勻。（7）14000 r/min離心10 min獲得沉淀，70%乙醇洗滌后在室溫下自然風干。（8）加入200 ?L TE緩沖液溶解DNA。（9）待DNA完全溶解后，RNaseA處理，并再次抽提。（10）獲得上清液后加入2倍體積的無水乙醇沉淀DNA。（11）70%乙醇洗滌沉淀，晾干后加入50 ?L TE緩沖液溶解，置于-20℃保存。

1.3.2 SDS法提取DNA 參見韓玉杰等[18]方法并進行改進。（1）取200 mg玫瑰干燥葉片，在液氮中研磨至粉末狀。（2）將粉末轉入1.5 mL離心管中，加入600 ?L 65℃預熱的SDS細胞提取液，搖勻后置于65℃中水浴保溫20 min，期間不時將離心管顛倒混勻。（3）取出離心管，冷卻至室溫，加入200 ?L 5 mol/L KAc溶液，混勻，冰浴20 min。（4）加入300 ?L氯仿，顛倒混勻，12000 r/min離心15 min。（5）將上清液轉移至新管中并加入等體積4℃預冷的異丙醇，輕輕混勻，-20℃放置30 min。（6）收集沉淀，用70%乙醇洗滌沉淀2次并晾干。（7）加入200 ?L TE緩沖液溶解DNA。（8）DNA完全溶解后，用RNaseA處理，并再次加入氯仿抽提。（9）得到上清液后加入2倍體積的無水乙醇沉淀DNA。（10）70%乙醇洗滌沉淀，晾干后加入50 ?L TE緩沖液溶解，置于-20℃保存。

1.3.3 改良CTAB法提取DNA 參見徐宗大[19]的試驗方法并進行改進。（1）取5～6片玫瑰干葉放于研缽中，加少許PVP，加入液氮迅速研磨成粉。（2）將約0.1 g粉末轉移至2 mL離心管中，加入800 ?L 65℃預熱的改良2×CTAB緩沖液和30 ?L β-巰基乙醇，充分混勻，65℃水浴40 min，期間每隔10 min顛倒混勻一次。（3）離心管取出冷卻至室溫，加入400 ?L Tris-飽和酚和400 ?L氯仿/異戊醇（24：1），顛倒混勻，12000 r/min離心15 min。（4）將上清液轉入2 mL離心管中，加入與上清液等體積的氯仿/異戊醇（24：1），混勻，12000 r/min離心10 min。（5）重復（4）操作。（6）上清液轉入1.5 mL離心管中，加入2倍清液體積的4℃預冷無水乙醇，輕輕搖動離心管，管內即有白色棉團狀DNA沉淀出現(xiàn)，-20℃放置30 min。（7）將沉淀挑入新管中，用70%乙醇洗滌2次。再用無水乙醇洗滌1次，于試驗臺靜置至乙醇揮發(fā)干凈。（8）加入50 ?L TE緩沖液溶解DNA。（9）待DNA完全溶解后，RNaseA處理樣品，置于-20℃保存。

1.3.4 試劑盒法提取DNA 采用TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒按說明書操作步驟提取玫瑰DNA。

1.4 DNA質量檢測

1.4.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測 瓊脂糖凝膠電泳是一種常用的DNA質量檢測方法。取2 ?L DNA樣品，與1 ?L ddH2O和2 ?L 6×Loading buffer混勻后點樣于濃度為0.8%的瓊脂糖凝膠中，在1×TAE電泳緩沖液，電壓120V下電泳。約30 min后取出放于EB染液中染色20 min，在紫外光下觀察電泳結果并拍照記錄。

1.4.2 DNA純度檢測 用紫外分光光度法檢測DNA樣品的純度與濃度。以ddH2O作為空白對照，測得玫瑰基因組DNA樣品在波長260、280處的OD值，并根據(jù)OD260/OD280判斷DNA的純度。

2 結果與分析

2.1 4種方法提取的基因組DNA電泳檢測結果與分析

4種方法提取不同品種玫瑰葉片基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1、2所示。結果表明，采用以上4種方法均可從干燥的玫瑰幼嫩葉片中提取到DNA，都可呈現(xiàn)一條亮帶，無明顯降解，且完整性較好。但SDS法和試劑盒法提取得到的DNA在點樣孔中有少許殘留物，說明這2種方法所提取的玫瑰DNA中摻有蛋白質等雜質。相比以上2種方法，CTAB法和改良CTAB法提取的DNA的點樣孔較清晰可見，表明殘留物少，基本上可排除DNA樣品中的雜質污染。從圖1、2對比來看，改良CTAB法提取到的DNA除‘紫枝玫瑰的2個樣品有少許拖尾外，效果與CTAB法相近。但在實際操作過程中，CTAB法提取到的DNA因含有少量的酚類雜質，產生褐色沉淀且不易溶解于TE緩沖液，而改良CTAB法因為在提取過程中加入了PVP和β-巰基乙醇，減少了酚類及多糖類物質對DNA的污染，得到白色棉絮狀DNA沉淀，提高了DNA的純度。因此，改良CTAB法可作為一種高質量提取玫瑰葉片基因組DNA的方法。

2.2 4種方法提取的基因組DNA樣品純度分析

用紫外分光光度法測定DNA純度時，純凈的DNA在260 nm及280 nm處的吸光度比值，即OD260/OD280=1.80。一般情況下，提取的基因組DNA的OD260/OD280在1.80～1.90之間時，說明為較純凈的DNA，質量較好[20]。4種方法提取到的玫瑰葉片總DNA的吸光度比值如表1所示。用SDS法提取的DNA樣品的OD260/OD280比值在1.63～1.78之間，總體偏低于正常值1.80，表明該DNA樣品中可能混有蛋白質或酚類物質。試劑盒法所提取的DNA OD260/OD280均大于1.90，結合瓊脂糖凝膠電泳分析，照片中的DNA較為完整，排除DNA斷裂的可能性，則可知該DNA樣品中可能含有較多RNA，應用RNA酶重新處理樣品。CTAB法和改良CTAB法相比于其他2種方法所提DNA的OD260/OD280比值較好，均在1.80～1.90之間，可見這2種方法對蛋白質、RNA等雜質去除的較為充分，DNA純度較高，完整性較好。仔細對比兩者還可發(fā)現(xiàn)，改良CTAB法提取的DNA純度較CTAB法更穩(wěn)定。從前3種方法所得DNA的濃度對比可知，SDS法提取的DNA濃度最低，說明該方法所獲得的DNA量較少，而CTAB法和改良CTAB法所得的DNA量較多。綜合來看，改良CTAB法所提取的DNA純度與濃度較高，能很好的滿足試驗要求，可作為一種優(yōu)選的提取方法。

3 討論與結論

結合瓊脂糖凝膠電泳檢測圖和DNA的純度表中數(shù)值綜合分析可知，4種提取方法都可從玫瑰葉片中提取到基因組DNA。但比較來看，SDS法提取的DNA樣品OD值在1.63～1.78之間，偏低于正常值1.80，說明其提取的DNA中蛋白質及酚類雜質較多且DNA濃度不高，所以不將其作為玫瑰葉片基因組DNA提取的首選方法；CTAB法和改良CTAB法提取DNA的效果相近，2種方法得到的DNA樣品OD值均在1.80～1.90之間，2種方法對雜質的去除都較為充分，DNA純度高，完整性好；改良CTAB法因其去除色素雜質的效果較好[20]且方法穩(wěn)定，因此相比于常規(guī)CTAB法更適合玫瑰基因組DNA的提??；試劑盒法提取的DNA樣品OD值都高于1.90，純度稍低，表明樣品中含有較多RNA，需RNAase的進一步純化，但相比于傳統(tǒng)方法操作步驟繁瑣耗時，有機試劑危害人體等缺點，其提取到的DNA濃度高，制備方法簡單、快捷、效率高。

本研究與以往類似的參考文獻相比，相同點在于都是利用幾種不同方法對某一植物材料基因組DNA進行提取，對比提取效果并選出最合適的提取方法；不同點在于由于試驗材料的不同進而得到的最佳提取方法也不同，如盧東柏等[9]利用改良后的SDS法能提取到高質量的棉花基因組DNA；邵峰等[10]發(fā)現(xiàn)高鹽低pH法更適合紫色辣椒基因組DNA的提取；本研究則認為改良CTAB法是更適合玫瑰基因組DNA提取的有機試驗方法，而試劑盒法則可作為一種新興的快速制備方法以供選用。玫瑰基因組DNA的提取除徐宗大[19]提出過的改良CTAB法外至今并無對該方面的比較研究，所以本研究以此為切入點開展試驗并取得了一定進展與創(chuàng)新。研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)有機提取方法以改良CTAB法為優(yōu)，試劑盒法作為新型試驗方法也可嘗試采用。并且，在與其他相關文獻的對比研究上還可得出結論：選用的方法雖然類似，但因選取的植物材料特性不同其最適宜的提取方法也不同，即使同為改良后的方法，因改良的側重點不同，切不可生搬硬套，要因材制宜。

此外，改良CTAB法作為一種高質量且經濟有效的提取玫瑰葉片基因組DNA的方法，應注意該方法在提取過程中的操作要點，以免因為操作原因影響DNA的提取質量。（1）取材。材料的選取對玫瑰DNA的提取質量有關鍵性的影響[20]。該試驗采用的材料是玫瑰的幼嫩葉片，以幼葉紅色褪去，葉片呈現(xiàn)鮮綠色時為最佳的取材時期，此時葉片中不僅DNA含量豐富且多糖、色素、酚類及蛋白質等次生代謝物質較少，便于去除，利于獲得高質量的DNA。當不便采取新鮮葉片使用時，采樣后應及時裝入帶有硅膠顆粒的塑封袋中使葉片迅速干燥，并于-20℃下保存，最大限度地減少DNA的降解。（2）磨樣和水浴時間。材料研磨不充分或水浴時間不夠都會影響DNA的產量[20]。因此，在用液氮研磨葉片材料時應多研磨幾次。研磨所得的粉末越細越好，粉末顏色以灰綠色或白綠色為最佳。為了獲得高質量的玫瑰DNA，在材料充分研磨的前提下，將水浴時間定為40 min，期間每隔10 min還要上下顛倒幾次，使得改良2×CTAB緩沖液能充分裂解細胞。（3）防止褐化。玫瑰葉片中的多糖、多酚、色素及蛋白質等次生代謝物質易使DNA在提取過程中出現(xiàn)褐化，造成DNA的質量下降[21]。改良2×CTAB緩沖液中含有高濃度的鹽，可有效沉淀多糖；提取過程中通過飽和酚、氯仿：異戊醇（24：1）的多次抽提，能有效去除蛋白質；β-巰基乙醇和PVP的加入，可防止酚氧化和酚類物質與DNA的結合[22]，最終通過乙醇的洗滌獲得高質量的DNA。（4）避免剪切力。除了DNA的純度對后續(xù)試驗影響較大外，DNA的完整性對試驗結果也有一定的影響[23]。DNA對剪切力非常敏感，為了得到片段較為完整的DNA，在提取過程中要盡量簡化操作步驟，減少轉移次數(shù)，并對離心速度和時間進行適當控制等；提取過程中應避免劇烈震蕩，溫和操作，用減去尖端的槍頭吸取上清液，吸取過程中避免產生氣泡。這樣可以得到片段較大的DNA，保證后期的擴增結果。

改良CTAB法作為對常規(guī)CTAB法的改進，提取到的玫瑰基因組DNA濃度高且片段完整，雜質少，色澤透明純凈，質量好，是提取玫瑰基因組DNA優(yōu)選的有機方法。但因其操作步驟的繁瑣和耗時性，該方法更適用于樣品材料不多，試驗時間充裕的情況下。試劑盒法作為一種新興的提取方法，能方便、快捷、高效地提取到符合操作要求的玫瑰基因組DNA，簡化了傳統(tǒng)方法的操作步驟且更加安全，但費用比傳統(tǒng)方法略高。因此，在經費允許的情況下，試劑盒法可作為一種快速制備玫瑰基因組DNA的方法以供選用。各實驗室可根據(jù)試驗條件，經費支出，人員配備等具體情況，結合這2種方法的優(yōu)缺點選擇合適的提取方法。在以后的研究中還要對目前的方法予以不斷改進，如進一步改良CTAB法，減少操作步驟，縮短操作時間；增強試劑盒法對復雜操作環(huán)境和植物材料的適應能力，保證穩(wěn)定高效的提取效果，降低使用成本等。希望日后的研究能在現(xiàn)有的基礎上探索出更完善、更適合玫瑰基因組DNA提取的方法。

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