商雨等

摘 要 以昆明地區(qū)傳統(tǒng)栽培的白花馬蹄蓮和彩色馬蹄蓮Ym035（橙紅復(fù)色）、Ym005（紅色）、Ym088（金黃色）、Ym002（淺粉色）和Ym064（紫紅色）為試驗(yàn)材料，進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，對雜交組合和結(jié)實(shí)率進(jìn)行分析，探索遠(yuǎn)緣雜交的親和性；設(shè)計(jì)4組不同激素組合，對雜交白化苗后代幼胚進(jìn)行胚拯救，探索最適于白化苗幼胚萌發(fā)的激素配比。結(jié)果表明，彩色馬蹄蓮做母本，結(jié)實(shí)率高于白花馬蹄蓮，白花馬蹄蓮地栽植株比盆栽的更為健壯，最佳組間雜交組合為：Ym002×白花馬蹄蓮（地栽），彩色馬蹄蓮組內(nèi)雜交以Ym005×Ym035雜交親和性較高；遠(yuǎn)緣雜交白化苗后代幼胚萌發(fā)的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

關(guān)鍵詞 馬蹄蓮；遠(yuǎn)緣雜交；白化苗；胚拯救

中圖分類號 S682.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract The cultivars of colored Zantedeschia hybrid： Ym035， Ym005， Ym088， Ym002，Ym064 and Zantedeschia aethiopica were used as the experimental materials. The setting rate of seeds was analyzed to find the best crossing combinations. Albino hybrids between Z. aethiopica and colored Z. hybrid were obtained by embryo rescue. Four different media were designed to explore the best one for embryo rescue. The results showed： the colored Z. hybrid was better as female parent than Z. aethiopica， and the best crossing combination was Ym002 × Z. aethiopic. Z. aethiopic planted in the ground was more vigorous than that planted in the pots. For the crossings in the Aestivae section， the combination of Ym005 × Ym035 had a higher affinity. MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L was the best media for embryo rescue of the albino hybrids from intersection hybridization.

Key words Zantedeschia spp.； Interspecific crossing； Albino seedling； Embryo rescue

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.002

馬蹄蓮（Zantedeschia spp.）為天南星科（Araceae）、馬蹄蓮屬（Zantedeschia）多年生草本球根花卉。馬蹄蓮屬包括兩個(gè)組：Zantedeschia組和Aestivae組。Zantedeschia組莖葉原產(chǎn)地冬季不落葉，具有長形、有分支的地下莖，花為白色，被稱為白花馬蹄蓮[1]。Aestivae組莖葉冬季枯萎、種球具有冬季休眠的特點(diǎn)，佛焰苞彩色，稱為彩色馬蹄蓮[2]。馬蹄蓮，尤其是彩色馬蹄蓮，花型獨(dú)特、色彩艷麗、花葉具賞，不但是極好的切花素材，盆花也受到消費(fèi)者的廣泛喜愛，被譽(yù)為21世紀(jì)“花卉之星”。

彩色馬蹄蓮雖然具有較高的觀賞價(jià)值和較好的市場前景，但由于其自身極易感染由歐文氏菌（Erwinia carotovora subsp. carotovora，現(xiàn)改名為Pectobacterium carotovora subsp. carotovora胡蘿卜軟腐果膠桿菌）引起的細(xì)菌性軟腐病而導(dǎo)致大面積死亡[3]，加之目前主要依賴進(jìn)口的彩色馬蹄蓮種球價(jià)格昂貴，導(dǎo)致彩色馬蹄蓮難以推廣種植，極大的限制了彩色馬蹄蓮的發(fā)展。與彩色馬蹄蓮不同，白花馬蹄蓮對歐文氏軟腐細(xì)菌天生具有高抗性[4]。但由于核質(zhì)不相容障礙（Plastome-genome incompatibility，PGI），白花馬蹄蓮和彩色馬蹄蓮種間雜交得到的均為白化苗[5]，限制了白花馬蹄蓮的抗性基因滲入到彩色馬蹄蓮中。因此研究馬蹄蓮PGI障礙所導(dǎo)致的種間雜交后代白化機(jī)制，可以為克服彩色馬蹄蓮細(xì)菌性軟腐病提供新的思路。

已經(jīng)有許多被子植物被報(bào)道有核質(zhì)不相容障礙，其中以馬蹄蓮[6]、月莧草[7]、杜鵑[8]中發(fā)生的最為普遍。白化是植物育種，特別是遠(yuǎn)緣雜交中常見的現(xiàn)象[9]。Yao等[10]曾經(jīng)對馬蹄蓮白化苗進(jìn)行抗病性檢測，從中篩選異養(yǎng)條件下的抗性雜種。遠(yuǎn)緣雜交對創(chuàng)造更為豐富的遺傳變異提供了可能性，國內(nèi)馬蹄蓮的雜交育種研究，多集中于組內(nèi)雜交，組間遠(yuǎn)緣雜交、雜交親和性研究尚未見報(bào)道。雜交后代敗育是遠(yuǎn)緣雜交育種難以進(jìn)行的主要障礙之一[11]。由于缺乏葉綠素，白化后代不能進(jìn)行光合作用，往往于種子萌發(fā)幾天之后死亡。利用胚拯救技術(shù)成功獲得離體白化苗，是研究白化苗特性和白化機(jī)制的重要基礎(chǔ)。利用胚拯救技術(shù)可以使原本不能正常結(jié)實(shí)的雜交組合獲得后代。胚拯救技術(shù)目前較常用于果樹栽培方面的研究，馬蹄蓮由于雜交后代常敗育，也較常使用胚拯救技術(shù)獲得大量材料[12]。

本試驗(yàn)以白花馬蹄蓮和5個(gè)不同彩色馬蹄蓮品種為親本，進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，探索馬蹄蓮遠(yuǎn)緣雜交親和性；運(yùn)用胚拯救技術(shù)成功獲得雜交后代的同時(shí)，探索白化后代幼胚離體生長的適宜培養(yǎng)基配方，為馬蹄蓮遠(yuǎn)緣雜交育種及PGI障礙導(dǎo)致的種間雜交后代白化機(jī)制的研究提供試驗(yàn)材料和技術(shù)支持，從而為進(jìn)一步的育種目標(biāo)——培育馬蹄蓮抗病新品種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 白花馬蹄蓮為昆明地區(qū)傳統(tǒng)栽培的白花馬蹄蓮品種，彩色馬蹄蓮品種主要由亞歐園藝花卉公司提供，其中除馬蹄蓮白花（地栽組）為地栽外，其它所有材料均為盆栽，所有彩色馬蹄蓮品種均為市場流行的栽培品種，且前期試驗(yàn)表明自交結(jié)實(shí)率較高。

1.1.2 主要儀器和試劑 解剖刀、育種專用套袋、酒精燈、超凈工作臺、鑷子、燒杯、玻棒等玻璃試劑儀器。MS培養(yǎng)基所需試劑、6-BA、NAA、75%酒精、2% NaClO、蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 去雄 當(dāng)馬蹄蓮雌蕊柱頭略有突起，開始分泌少量黏液時(shí)去雄。用蘸過75%酒精的解剖刀將整個(gè)肉穗花序上的雄蕊切除，并將切除的雄蕊置于玻璃培養(yǎng)皿中。在干燥情況下，2～3 d后雄蕊會分泌花粉。對分泌的花粉進(jìn)行收集，一般干燥條件下，花粉活力可以維持7 d，但最好不超過5 d進(jìn)行雜交授粉。

1.2.2 雜交 去除雄蕊的馬蹄蓮2～3 d后，雌蕊開始分泌黏液，此時(shí)進(jìn)行雜交。醫(yī)用棉棒蘸取適量花粉，均勻的涂抹在雌蕊柱頭上，使柱頭的每個(gè)突起均有花粉黏液。試驗(yàn)主要進(jìn)行兩類，一類是馬蹄蓮白花組和彩色組雜交，需在白花馬蹄蓮柱頭涂抹彩色馬蹄蓮花粉，彩色馬蹄蓮柱頭涂抹白花馬蹄蓮花粉，將6個(gè)不同品種分為8組，每組均設(shè)正反交實(shí)驗(yàn)，共16個(gè)雜交組合（Ym005由于品種數(shù)量不夠，沒有加入組間雜交試驗(yàn)）；另一類是馬蹄蓮彩色組間雜交，選取不同品種彩色馬蹄蓮進(jìn)行雜交，并注意正反交5個(gè)不同彩色馬蹄蓮品種共20個(gè)雜交組合。具體雜交情況見表1、表2。雜交授粉結(jié)束后，用育種袋對花朵進(jìn)行套袋處理，防止其他花粉的干擾。一般授粉兩周后，果實(shí)開始膨大，60 d后可以開始采摘進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.2.3 胚拯救 試驗(yàn)材料為馬蹄蓮組內(nèi)雜交后代果實(shí)，彩色馬蹄蓮組間雜交未產(chǎn)生白化苗，本試驗(yàn)僅采用白化苗后代作胚拯救材料。將果實(shí)采收后，用洗衣粉清洗干凈，蒸餾水中浸泡30 min后置于超凈工作臺內(nèi)。無菌條件下，75%的酒精浸泡約30 s，取出后放于2%的NaClO中消毒10 min左右。消毒結(jié)束后，無菌水清洗3遍，將果實(shí)表面擦拭酒精，在酒精燈上灼燒約30 s，至果實(shí)表面子房微微皺縮即可。

外植體消毒結(jié)束后，小心取出包裹于子房內(nèi)的胚珠，再用手術(shù)刀輕輕剝離珠被，注意不要傷害到幼胚。去除珠被后，可將幼胚置于培養(yǎng)皿中，幼胚褐色生長點(diǎn)必須向上。本試驗(yàn)培養(yǎng)基配方總共有4種，每種培養(yǎng)基接種25瓶，每瓶接種幼胚2個(gè)。具體配方及萌發(fā)情況見表3。

上述培養(yǎng)基均在普通MS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，添加蔗糖30 g，瓊脂粉6.3 g。接種后置于溫度25 ℃，光照40 μmol/（m2·s）的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交親和性及結(jié)實(shí)情況

2.1.1 馬蹄蓮組間雜交不同母本類型結(jié)實(shí)率差異

不同組別正反交結(jié)實(shí)情況見圖1，不同母本類型總體結(jié)實(shí)率情況見圖2。由圖1、圖2可以看出，白花組作為母本的雜交組合，結(jié)實(shí)情況不如彩色組為母本。除F組外，其余組別彩色馬蹄蓮為母本時(shí)的親和性均比白花馬蹄蓮為母本時(shí)好。以白花馬蹄蓮為母本的雜交組合，總結(jié)實(shí)率為17.5%，而以彩色馬蹄蓮為母本的雜交組合總結(jié)實(shí)率高達(dá)25.6%。兩者之間差異顯著。雜交進(jìn)行14 d后，彩色馬蹄蓮為母本的雜交組合開始出現(xiàn)雌蕊膨大現(xiàn)象，白花馬蹄蓮作為母本的雜交組合20 d以后膨大。白花馬蹄蓮為母本的雜交組合，雜交后50 d即可進(jìn)行胚拯救，彩色馬蹄蓮胚拯救的最佳時(shí)期則需要60～70 d，不同成熟時(shí)間不會影響胚拯救結(jié)實(shí)率。

2.1.2 栽培方式對白花馬蹄蓮雜交結(jié)實(shí)率的影響

白花組做母本的雜交組合，不同栽培方式的結(jié)實(shí)率有較大差異（圖3）。

以白花（盆栽）作為母本的雜交組合大多敗育，結(jié)實(shí)率只有11.8%。而以白花（地栽）作為母本的雜交組合結(jié)實(shí)情況相對較好，結(jié)實(shí)率有20%。

2.1.3 組間雜交彩色組做母本品種間結(jié)實(shí)差異

彩色馬蹄蓮做母本，不同雜交組合間的結(jié)實(shí)情況見圖4。

以彩色馬蹄蓮作為母本的雜交組合，結(jié)實(shí)率都比較好，Ym002作母本結(jié)實(shí)率最高。橙紅復(fù)色品種Ym035為母本的雜交組合中，早期膨大明顯，但后期多敗育。Ym088純正金黃色的品種，大部分由于軟腐病而未結(jié)實(shí)。Ym002是花色接近白色的粉白色品種，結(jié)實(shí)率最高。Ym064為深紫色馬蹄蓮品種，所結(jié)果實(shí)比其他品種大，便于后期胚拯救的操作。

2.1.4 彩色馬蹄蓮組內(nèi)雜交母本結(jié)實(shí)情況 彩色馬蹄蓮組內(nèi)雜交其母本結(jié)實(shí)情況見圖5。

在進(jìn)行彩色馬蹄蓮組內(nèi)雜交試驗(yàn)過程中，各雜交組合之間結(jié)實(shí)率差異較大。Ym005與橙紅復(fù)色的Ym035為母本，結(jié)實(shí)率最高，分別為61.3%和41.4%。Ym005品種資源較少，已逐漸退出市場，Ym035結(jié)實(shí)率高主要是由于品種粗壯，不易感染軟腐病。而Ym088是最容易感染軟腐病的品種，其結(jié)實(shí)率只有17.4%。Ym064和Ym002為母本的雜交組合，結(jié)實(shí)率分別為21.6%和28.6%。

2.2 不同激素對雜交幼胚萌發(fā)的影響

在選擇的4種不同的激素水平中，對比6-BA含量不同，NAA含量相同的Ⅰ、Ⅳ組和Ⅱ、Ⅲ組發(fā)現(xiàn)，6-BA量的多少對幼胚的萌發(fā)起著關(guān)鍵作用，6-BA含量為1.0 mg/L的培養(yǎng)基萌發(fā)率顯著多于0.5 mg/L。從NAA含量不同，6-BA含量相同的Ⅰ、Ⅲ組和Ⅱ、Ⅳ組可以看出，NAA含量增加從一定程度上增大幼胚的萌發(fā)率，但效果沒有6-BA明顯。萌發(fā)率最高的培養(yǎng)基配方為6-BA添加1.0 mg/L，NAA添加0.1 mg/L，萌發(fā)率高達(dá)74%（表3）。

幼胚接種后大約14 d開始萌發(fā)，白花馬蹄蓮為母本的幼胚萌發(fā)時(shí)間比彩色馬蹄蓮為母本稍早。萌發(fā)約80 d后，可以進(jìn)行正常轉(zhuǎn)接。為了轉(zhuǎn)接后植株的生長，培養(yǎng)基可適當(dāng)增加6-BA的含量。離體培養(yǎng)3代后，馬蹄蓮白化苗數(shù)量見表4。

3 討論與結(jié)論

3.1 馬蹄蓮雜交親和性的不同

研究結(jié)果表明，在相同條件下，彩色馬蹄蓮作為母本雜交親和性高于白花馬蹄蓮。同一雜交親本不同正反交試驗(yàn)中，除Ym088外，其余彩色馬蹄蓮品種做母本結(jié)實(shí)率均高于白花馬蹄蓮，說明彩色馬蹄蓮相較于白花馬蹄蓮，雌蕊的生長活性更強(qiáng)。這可能是由于供試的幾個(gè)彩色馬蹄蓮品種均為經(jīng)過多次改良、自交結(jié)實(shí)率高的品種。

彩色馬蹄蓮為母本的雜交組合都有較好的結(jié)實(shí)率，以Ym002為母本的結(jié)實(shí)率最高。Ym002為最接近白色的粉白色品種，與白花馬蹄蓮親緣關(guān)系較近可能是雜交結(jié)實(shí)率相對較好的原因。Ym088植株較易感染軟腐病，不建議作為馬蹄蓮白化苗的母本選擇。Ym035抗病能力最強(qiáng)，但試驗(yàn)中頻繁出現(xiàn)授粉初期雌蕊膨大較為明顯，但后期不繼續(xù)發(fā)育的現(xiàn)象?？赡苁怯捎诨ǚ壑慌c卵核或極核發(fā)生單受精所致[13]。另外，即使在使用進(jìn)口盆栽基質(zhì)的情況下，地栽白花馬蹄蓮的結(jié)實(shí)情況還是遠(yuǎn)好于盆栽白花馬蹄蓮，可能是白花馬蹄蓮根系發(fā)達(dá)，地栽條件為其提供了充分的生長空間。

顏色也是彩色馬蹄蓮原種分類的主要依據(jù)之一[14]，本試驗(yàn)選擇不同顏色的彩色馬蹄蓮作親本，所有雜交組合中未產(chǎn)生完全白化苗。說明彩色馬蹄蓮栽培品種經(jīng)過多次組合雜交后，聚合了多個(gè)親本的基因，已無法從顏色判斷其遺傳組成、將其作為雜交親本組合的依據(jù)。尋找更好的鑒別方法，如現(xiàn)代分子標(biāo)記技術(shù)等，將是促進(jìn)馬蹄蓮育種的有效方法。彩色馬蹄蓮組內(nèi)雜交，粉色的Ym002和具有相對較好抗軟腐病能力的Ym064雜交親和性較差；Ym005品種具有較高的雜交親和性；Ym035作為市場的新寵，也有較高的雜交親和性。

3.2 不同激素對白化苗幼胚萌發(fā)率的影響

不同激素對白化苗幼胚離體培養(yǎng)的效果影響很大。通過試驗(yàn)表明，在MS培養(yǎng)基中附加1.0 mg/L的6-BA和0.1 mg/L的NAA最適宜白化苗幼胚萌發(fā)，6-BA對白化苗幼胚培養(yǎng)萌發(fā)率的影響要遠(yuǎn)高于NAA，試驗(yàn)結(jié)果與彩色馬蹄蓮胚拯救[12]結(jié)果相似。但關(guān)于更多激素種類及濃度對白化苗生長的影響還需進(jìn)一步試驗(yàn)探索。

胚拯救技術(shù)在外源供給營養(yǎng)的條件下，使不能自養(yǎng)的白化苗在較短時(shí)間內(nèi)迅速擴(kuò)繁，數(shù)量增加90多倍。試驗(yàn)結(jié)果表明，外源供給營養(yǎng)的條件下，馬蹄蓮白化苗的生長速度與分化情況與普通綠色苗無明顯差異，這一發(fā)現(xiàn)為PGI障礙導(dǎo)致的馬蹄蓮遠(yuǎn)緣雜交后代白化機(jī)制的認(rèn)識提供了重要啟示，胚拯救技術(shù)獲得了離體培養(yǎng)的白化苗，不但為其白化分子機(jī)制的研究提供了材料，也對克服馬蹄蓮核質(zhì)不親和障礙進(jìn)而創(chuàng)造兼具抗性和觀賞性的新品種具有重要意義。

參考文獻(xiàn)

[1] Letty C. The genus Zantedeschia[J]. Bothalia， 1973， 11（1）： 25-26.

[2] Earl G. Chromosome numbers and speciation in the genus Zantedeschia[J]. Plant Life， 1957， 13： 140-146.

[3] Krejzar V， Mertelik J， Pankova I， et al. Pseudomonas marginalisassociated with soft rot of Zantedeschia spp[J]. Plant Protect Sci， 2008， 44： 85-90.

[4] Snijder R C， Van Tuyl J M. Disease test to soft rot caused by Erwinia carotovora subsp. Carotovora for tubers and seedlings of Zantedeschia（Araceae）[J]. Eur Journal of Plant Pathology， 2002， 108： 565-571.

[5] Snijder R C， Cho H R， Hendriks M M W B， et al. Genetic variation in Zantedeschia spp.（Araceae）for resistance to soft rot caused by Erwinia carotovora subsp. Carotovora[J]. Euphytica， 2004， 135： 119-128.

[6] Yao J L， Cohen D， Rowland R E. Plastid DNA inheritance and plastome-genome incompatibility in interspecific hybrids of Zantedeschia（Araceae）[J]. Theor Appl Genet， 1994， 88： 255-260.

[7] Hupfer H， Swiatek M， Hornung S， et al. Complete nucleotide sequence of the Oenother aelate plastid chromosome， representing plastome I of the five distinguishable Euoenthera plastomes[J]. Mol Gen Genet， 2000， 263： 581-585.

[8] Michishita E， Matsumura N， Kurahashi T， et al. 5-Halogena analogues induce a senescene-like phenomenon in HeLa cells[J]. Biosci Biote， 2002， 66： 877-901.

[9] Kumari M， Clarke H J， Small I， et al. Albinism in Plants： A major bottleneck in wide hybridization， androgenesis and doubled haploid culture[J]. Critical Reviews in Plant Sciences， 2009， 28（6）： 393-409.

[10] Yao J L， Cohen D. Multiple gene control of plastome-genome incompatibility and plastid DNA inheritance in interspecific hybrids of Zantedeschia[J]. Theor Appl Genet， 2000， 101： 400-406.

[11] Van Creij M G M， Kerckhoffs D M J， Van Tuyl J M. Interspecific cross in genus Tulipa L. identificaition of pre-fertilization barriers[J]. Sexual Plant Reproduction， 1997， 10： 116-123.

[12] 陳 溪， 楊 輝， 周 滌， 等. 彩色馬蹄蓮胚拯救技術(shù)研究[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2012， 33（2）： 286-289.

[13] 李辛雷， 陳發(fā)棣， 趙宏波. 菊屬植物遠(yuǎn)緣雜交親和性研究[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2008， 35（2）： 257-262.

[14] Singh Y， Van Wyk A E， Baijnath H. Floral biology of Zantedeschia aethiopica（L.）spreng（Araeeae）[J]. South African Journal of Botany， 1996， 62（3）： 146-150.