陳志寬　張楊　賴育菠　劉順會(huì)　陸幸妍

摘要[目的]探討胡蘿卜、土豆、番茄的浸提液對(duì)土人參愈傷組織的多糖和黃酮含量影響。[方法]在土人參愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中分別添加胡蘿卜、土豆、番茄浸提液誘導(dǎo)愈傷組織生成，培養(yǎng)25 d后，用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定土人參愈傷組織多糖和黃酮的含量。[結(jié)果]3種浸提液都能提高土人參愈傷組織多糖含量（P<0.01）；其中以添加胡蘿卜浸提液的最高，但胡蘿卜浸提液對(duì)土人參愈傷組織的黃酮含量沒有顯著影響（P>0.05）；土豆浸提液和番茄浸提液則使土人參愈傷組織黃酮含量降低（P<0.05）。[結(jié)論]培養(yǎng)基中添加胡蘿卜、土豆和番茄浸提液有助提高土人參愈傷組織的多糖含量，但未能提高甚至?xí)档推潼S酮含量。

關(guān)鍵詞土人參[Talinum paniculatum （Jacq.）Gaertn]；愈傷組織；植物浸提液；多糖；黃酮

中圖分類號(hào)S567文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）07-01910-03

基金項(xiàng)目廣東藥學(xué)院2012年省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（1057312001）；廣東藥學(xué)院2012年校級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（14）。

作者簡(jiǎn)介陳志寬（1990-），男，廣東廉江人，本科，專業(yè)：生物技術(shù)。*通訊作者，劉順會(huì)，副教授，從事生態(tài)學(xué)研究。*通訊作者，陸幸妍，副教授，從事細(xì)胞生物學(xué)研究。

收稿日期20140210土人參[Talinum paniculatum （Jacq.）Gaertn]，又名人參菜，屬馬齒莧科1年生或多年生草本植物[1]，主要分布于安徽、河南、廣西、廣東、四川、貴州和云南等地。土人參含環(huán)烯醚萜、蒽醌類、多糖、黃酮類和揮發(fā)油等化合物[2]，主要用于治療氣虛乏力、肺癆咳血、眩暈和月經(jīng)不調(diào)等[3]。隨著土人參食療功效研究的深入開展，作為一種集食用、藥用、觀賞為一體的新型保健食材，其潛在價(jià)值正日益顯現(xiàn)。

植物多糖是單糖通過糖苷鍵連接而成的聚合物，是一類重要的信息分子。研究發(fā)現(xiàn)，多糖及糖復(fù)合物參與和介導(dǎo)了細(xì)胞各種生命現(xiàn)象的調(diào)節(jié)，具有免疫調(diào)節(jié)、降血糖血脂和抗凝血等生物活性[4]。冉靚等還發(fā)現(xiàn)，土人參多糖對(duì)PC12細(xì)胞的生長(zhǎng)有一定促分化作用[5]。黃酮類化合物是具有多種的生物學(xué)活性的次生代謝產(chǎn)物。研究表明，土人參黃酮具有清除羥自由基、超氧離子自由基的作用，其抗氧化性明顯[6]。

自20世紀(jì)90年代對(duì)土人參的研究開展以來，對(duì)土人參化學(xué)成分的研究大多從檢測(cè)和藥理兩個(gè)層面深入，而設(shè)計(jì)試驗(yàn)影響土人參化學(xué)成分含量的研究并不多見。試驗(yàn)在借鑒自然界不同植物品種之間存在相生相克特性的背景之下，探討胡蘿卜、土豆、番茄3種浸提液的添加培養(yǎng)對(duì)土人參愈傷組織中多糖和黃酮含量的影響，以期為進(jìn)一步探究植物組織培養(yǎng)過程中不同植物品種材料之間相互作用的機(jī)制提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并為土人參這一新型保健食材的開發(fā)利用提供借鑒。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對(duì)象。土人參植株，由廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院劉順會(huì)副教授饋贈(zèng)，取其新鮮、嫩綠葉片作為組培材料。

1.1.2主要儀器。SB5200D超聲波清洗機(jī)，購(gòu)自寧波新芝生物有限公司；TGL16G離心機(jī)，購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠；759紫外可見分光光度計(jì)，購(gòu)自上海菁華科技儀器有限公司；TE212L電子天平，購(gòu)自SARTORIUS CO.GERMANY。

1.1.3主要試劑。濃硫酸，購(gòu)自衡陽市凱信化有限公司；蒽酮，購(gòu)自Aladdin industrial corporation；蘆丁，購(gòu)自Aladdin chemistry co.Ltd；無水葡萄糖、硝酸鋁、亞硝酸鈉、無水乙醇均為分析純，購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠。

1.2方法

1.2.1材料的預(yù)處理。取新鮮外植體，消毒后切成 0.1 cm3大小接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)10 d?；A(chǔ)培養(yǎng)基為：MS+2.0 mg/L 6BA+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖。

1.2.2植物浸提液的制備。分別稱取削皮后的胡蘿卜、土豆和番茄各100.00 g，切碎后放入攪拌機(jī)中，統(tǒng)一加入50 ml單蒸水，攪拌至成勻漿狀態(tài)。取出所有勻漿過8層紗布，丟棄殘?jiān)瑸V液用12 000 r/min離心，取上清液備用。在無菌操作條件下，吸取上清液透過0.22 μm濾膜，將濾液收集在已高壓滅菌的15 ml離心管中。

1.2.3含植物浸提液培養(yǎng)基的制備。對(duì)基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行高壓滅菌，待其無菌培養(yǎng)基冷卻15 min后，吸取2 ml無菌浸提液加入到23 ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，用槍反復(fù)吹打并搖勻，待其完全冷卻凝固備用。

1.2.4愈傷組織培養(yǎng)。將土人參愈傷組織轉(zhuǎn)移至含植物浸提液的培養(yǎng)基中，在光照度2 000 lx、12 h/d條件下培養(yǎng)25 d，每天觀察愈傷組織狀態(tài)。

1.2.5對(duì)照品溶液和供試樣品液的制備。（1）測(cè)黃酮含量的樣品制備。稱取干燥愈傷組織粉末0.400 g，按照乙醇濃度80%，料液比1∶40（g/ml，W/V，下同），浸提溫度60 ℃，浸提時(shí)間1 h，離心得上清液，定容至25 ml備用。（2）測(cè)多糖的樣品制備。稱取干燥愈傷組織粉末0.200 g，置于100 ml錐形瓶中，加沸水25 ml，加蓋，超聲提取10 min，冷卻后抽濾，殘?jiān)梅姓麴s水反復(fù)洗滌并抽濾，濾液收集在50 ml容量瓶中，定容至刻度，得可溶性糖的提取液。吸取提取液2 ml，置于另一50 ml容量瓶中，以蒸餾水定容，搖勻備用。

1.2.6測(cè)定波長(zhǎng)的選擇。（1）精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液1.0 ml，置20 ml試管中，加入蒽酮溶液2.0 ml，參照紫外-可見分光光度法（2010版藥典附錄VA）測(cè)定，觀察紫外吸收光譜，確定最佳測(cè)定波長(zhǎng)。（2）精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液1.0 ml于50 ml容量瓶，加濃度5%的NaNO2 1.5 ml搖勻，放置6 min后；加濃度10%的Al（NO3）3 1.5 ml，搖勻，放置6 min；再加20 ml濃度4%的NaOH溶液，搖勻顯色，用濃度80%乙醇定容，搖勻靜置10 min，觀察紫外吸收光譜，確定最佳測(cè)定波長(zhǎng)。

1.2.7線性關(guān)系的考察。（1）葡萄糖線性關(guān)系的考察。精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，按“1.2.6”項(xiàng)下蒽酮比色法顯色，以蒸餾水為空白對(duì)照，于波長(zhǎng)626 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C（μg/ml）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。（2）蘆丁線性關(guān)系的考察。精密吸取0.3、0.6、0.9和1.2 ml蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，按“1.2.6”項(xiàng)下硝酸鋁絡(luò)合顯色法，以濃度80%乙醇為空白對(duì)照，于波長(zhǎng)254 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C（mg /ml）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。

1.2.8精密測(cè)定與計(jì)算。按上述方法測(cè)定各組的多糖和黃酮吸光度值，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計(jì)算得出提取液中多糖或黃酮濃度，根據(jù)下列公式求出各組多糖和黃酮的百分含量。

多糖/黃酮的含量=CV總D1mV測(cè)×100%

式中：C（mg/ml）：由回歸方程得出的多糖或黃酮濃度；V總（ml）為土人參多糖和黃酮提取液的總體積；V測(cè)（ml）為測(cè)定時(shí)取用樣品的體積；D為稀釋倍數(shù)；m（mg）為樣品質(zhì)量。

1.2.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間多重比較采用單向方差分析（OneWay ANOVA）。P<0.05為差異有顯著性，P<0.01為差異有極顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1測(cè)定波長(zhǎng)的選擇葡萄糖溶液的紫外吸收光譜顯示，λmax=626 nm，故選擇626 nm為多糖測(cè)定波長(zhǎng)。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的紫外吸收光譜顯示，λmax=254 nm，故選擇254 nm為黃酮測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2線性關(guān)系的考察計(jì)算得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的線性回歸方程為：Y=0.011 3X-0.020 2，相關(guān)系數(shù)R為0.998 8。試驗(yàn)結(jié)果表明，在0.200～1.200 mg/ml范圍內(nèi)，葡萄糖濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。計(jì)算得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的線性回歸方程為：Y=248.600 0X+0.063 1，相關(guān)系數(shù)R為0.990 7。試驗(yàn)結(jié)果表明，在0.400～1.800 mg/ml范圍內(nèi)，蘆丁濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.3含植物浸提液培養(yǎng)基對(duì)土人參多糖含量的影響圖1表明，與對(duì)照組相比，胡蘿卜組和土豆組的多糖含量均顯著提高（P<0.01），其中胡蘿卜組的多糖含量高于對(duì)照組的7.5%，增長(zhǎng)89.1%；土豆組的高于對(duì)照組的5.6%，增長(zhǎng)66.7%；番茄組的沒有顯著性差異（P>0.05）。與番茄組相比，胡蘿卜組和土豆組的多糖含量亦是極顯著高于番茄組（P<0.01），分別相差6.7%和4.8%；與土豆組相比，胡蘿卜組無顯著性差異（P>0.05）。

注：與對(duì)照組比較**P<0.01；與番茄組比較##P<0.01。

圖1不同植物浸提液添加培養(yǎng)對(duì)土人參愈傷組織多糖含量的影響（n=3）2.4含植物浸提液培養(yǎng)基對(duì)黃酮含量的影響圖2表明，相比對(duì)照組的黃酮含量，土豆組和番茄組的黃酮含量顯著低于對(duì)照組（P<0.05），分別降低0.3%和0.5%；而胡蘿卜組的黃酮含量與對(duì)照組的黃酮含量?jī)H相差0.1%，無顯著性差異（P>0.05）。與胡蘿卜組比較，土豆組和番茄組的黃酮含量顯著低于胡蘿卜組的黃酮含量（P<0.05），分別相差0.4%和0.6%；而番茄組和土豆組的黃酮含量相比則無顯著性差異（P>0.05）。