倫志明　池玉杰　韓樹(shù)英　尹立偉

摘要[目的]研究野生花臉香蘑子實(shí)體多糖的最佳提取工藝條件。[方法]采用熱水浸提法提取野生花臉香蘑子實(shí)體多糖，通過(guò)單因素試驗(yàn)研究浸提時(shí)間、浸提溫度、料液比、提取次數(shù)對(duì)多糖得率的影響，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗(yàn)獲得最佳提取工藝。[結(jié)果]在提取次數(shù)為2次的前提下，野生花臉香蘑子實(shí)體多糖的最佳提取工藝條件為：浸提溫度65 ℃，料液比1∶40（g/ml），提取時(shí)間5 h；在此條件下，提取花臉香蘑子實(shí)體水溶性多糖，得率為10.39%。[結(jié)論]試驗(yàn)優(yōu)選了野生花臉香蘑子實(shí)體多糖的提取工藝條件，為野生花臉香蘑多糖的生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞野生花臉香蘑[Lepista sordida （Schum.：Fr.）Sing]；多糖；正交試驗(yàn)

中圖分類(lèi)號(hào)S567文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）07-02113-03

基金項(xiàng)目黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C200931）。

作者簡(jiǎn)介倫志明（1971-），女，黑龍江海倫人，副教授，博士研究生，從事食用菌相關(guān)方面研究。

收稿日期20140217食藥用真菌中具有藥理活性的物質(zhì)有很多，而多糖則是其中最廣為人知、最有效的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性物質(zhì)，它們可以從食藥用真菌的子實(shí)體、菌絲體和發(fā)酵液中分離出來(lái)[1]。從20世紀(jì)70年代開(kāi)始，菌絲中提取的云芝多糖、子實(shí)體中提取的香菇多糖和發(fā)酵液中提取的裂褶菌多糖在抗癌臨床治療方面取得了良好效果[2]。40多年間，各國(guó)學(xué)者對(duì)包括靈芝、云芝、灰樹(shù)花、平菇、蛹蟲(chóng)草、黑木耳等在內(nèi)的近700種擔(dān)子菌多糖的活性進(jìn)行了研究[3]。結(jié)果顯示，這些多糖表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗病毒、降低血糖和降低血脂等多種藥理活性[4-10]，而且由于天然、毒副作用小的特點(diǎn)，使它們成為了潛力巨大的功能性食品和藥物的來(lái)源。自然界的食藥用真菌約有140 000種，人類(lèi)已知的約有14 000種[11]，仍有龐大的食藥用真菌群體做為多糖資源去等待人類(lèi)開(kāi)發(fā)與利用。

花臉香蘑[Lepista sordida （Schum.：Fr.）Sing]為傘菌目（Agaricales）口蘑科（Tricholomataceae）香蘑屬（Lepista）真菌，廣泛分布于黑龍江、河北、河南、甘肅、青海、四川、新疆、西藏、山西、內(nèi)蒙古、廣西、云南、湖南、重慶、貴州、江西和福建等地[12]。因生物轉(zhuǎn)化率較低，子實(shí)體易碎，不耐運(yùn)輸，目前尚未大面積推廣栽培，市場(chǎng)上完全依賴(lài)于野生資源。對(duì)于這種氣味濃香、色澤宜人、味道鮮美、在民間享有很高知名度的名貴食用菌，多糖的研究才剛剛開(kāi)始。張振宇等以中藥渣對(duì)花臉香蘑進(jìn)行固體發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)其粗多糖提取物在一定濃度下對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性具有明顯增強(qiáng)作用[13]。另有研究表明，花臉香蘑多糖具有抗腫瘤活性[14]，對(duì)肝細(xì)胞有保護(hù)作用[15-16]。孟玲等對(duì)花臉香蘑菌絲多糖的發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，在適量蔗糖、蛋白胨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀，蒸餾水1 000 ml的培養(yǎng)條件下，菌絲體多糖提取率最高[17]。筆者以野生花臉香蘑子實(shí)體為原料，采用單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)優(yōu)化花臉香蘑多糖的熱水提取工藝，以期為花臉香蘑多糖的開(kāi)發(fā)和利用提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1 研究對(duì)象?；樝隳?，采自黑龍江省齊齊哈爾市雙河農(nóng)場(chǎng)，經(jīng)形態(tài)觀(guān)察及ITS序列分析鑒定為花臉香蘑（Lepista sordida），序列已經(jīng)提交GenBank，序列編號(hào)為KF874612。

1.1.2 主要儀器。DKS26恒溫水浴鍋，購(gòu)自上海森信試驗(yàn)儀器有限公司；Cary50紫外分光光度計(jì)，購(gòu)自美國(guó)VARIAN公司；SORVALL LEGEND RT臺(tái)式冷凍離心機(jī)，購(gòu)自德國(guó)Heraeus公司；FD5505真空冷凍干燥機(jī)，購(gòu)自美國(guó)SIM公司；FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，購(gòu)自北京中興偉業(yè)儀器有限公司；循環(huán)水真空泵，購(gòu)自鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.1.3 主要試劑。葡萄糖、重蒸酚、濃硫酸和95%乙醇等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，市售。

1.2方法

1.2.1 試驗(yàn)樣品預(yù)處理。取花臉香蘑子實(shí)體，自然風(fēng)干后，置于60 ℃烘箱中烘至恒重，以高速萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩，加入8倍體積濃度95%乙醇，室溫放置過(guò)夜，抽濾后，上清液密封放置，沉淀復(fù)加乙醇，過(guò)夜、抽濾，如此反復(fù)操作3次，合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇，沉淀置陰涼通風(fēng)處風(fēng)干，備用。

1.2.2 苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量[18]。

1.2.2.1 苯酚溶液配制。稱(chēng)取80.00 g重蒸苯酚，加入20 ml蒸餾水使之溶解，制成濃度80%苯酚溶液，置于4 ℃冰箱中避光保存，使用前加蒸餾水稀釋成濃度6%苯酚溶液。

1.2.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。稱(chēng)取葡萄糖10.0 mg，105 ℃烘至恒重，加蒸餾水溶解定容至250 ml，配制成40 μg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2.3 線(xiàn)性關(guān)系的考察。用移液器吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6和1.8 ml，置于10 ml離心管中，以蒸餾水補(bǔ)充至2.0 ml，以2.0 ml蒸餾水作為空白對(duì)照，各加入1.0 ml濃度6%苯酚溶液，混合均勻，再加入5.0 ml濃硫酸，振蕩搖勻，沸水浴中加熱15 min，取出后用自來(lái)水冷卻，紫外分光光度計(jì)測(cè)490 nm波長(zhǎng)處吸光度，以吸光度為（Y）縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度（X，μg/ml）為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算線(xiàn)性回歸方程。

1.2.2.4 花臉香蘑多糖提取得率的測(cè)定。多糖提取率按下列公式計(jì)算：多糖提取率（%）= （C×V×D/M）×100；其中，C為提取液中葡萄糖濃度（mg/ml），V為提取液容積（ml），D為提取液稀釋倍數(shù)，M為試驗(yàn)樣品質(zhì)量（mg）。

1.2.3 花臉香蘑多糖提取單因素試驗(yàn)。（1）料液比對(duì)花臉香蘑多糖的影響。取花臉香蘑子實(shí)體粉末10.00 g，稱(chēng)取5份，按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/ml，W/V，下同），在95 ℃條件下浸提2 h，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，浸提后提取液離心，測(cè)量容積，取1.0 ml提取液，稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，按苯酚-硫酸法用紫外分光光度計(jì)測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處吸光度，比較不同料液比條件下的多糖提取率。（2）提取溫度對(duì)花臉香蘑多糖的影響。取花臉香蘑子實(shí)體粉末10.00 g，稱(chēng)取7份，按上述試驗(yàn)確定的料液比，分別于35、45、55、65、75、85和95 ℃水浴中加熱2 h，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，浸提后提取液離心，測(cè)量容積，取1.0 ml提取液，稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，用苯酚-硫酸法在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，比較不同溫度條件下的多糖提取率。（3）提取時(shí)間對(duì)花臉香蘑多糖的影響。取花臉香蘑子實(shí)體粉末10.00 g，稱(chēng)取5份，按上述試驗(yàn)確定的料液比和溫度，分別提取1、2、3、4和5 h，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，浸提后提取液離心，測(cè)量容積，取1.0 ml提取液，稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，按苯酚-硫酸法在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，比較不同時(shí)間條件下的多糖提取率。（4）提取次數(shù)對(duì)花臉香蘑多糖的影響。取花臉香蘑子實(shí)體粉末10.00 g，稱(chēng)取4份，按上述試驗(yàn)確定的料液比、溫度和時(shí)間，分別提取1、2、3和4次，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，浸提后提取液離心，合并上清液，測(cè)量容積，取1.0 ml提取液，稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，按上述苯酚-硫酸法在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，比較不同提取次數(shù)條件下的多糖提取率。

1.2.4 正交試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以提取溫度（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）為考察因素，采用L9（33）正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)組合（表1），每個(gè)組合設(shè)置3個(gè)重復(fù)，提取次數(shù)為2次，使用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS17.0分別對(duì)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1線(xiàn)性關(guān)系的考察 計(jì)算得線(xiàn)性回歸方程為：Y=0.014 9X-0.002 6，R2=0.997 3。試驗(yàn)結(jié)果表明，在1.6～7.2 μg/ml范圍內(nèi)，葡萄糖濃度與吸光度的線(xiàn)性關(guān)系良好。