韓樹(shù)英 池玉杰 薛煜

摘要 [目的]獲得一株可降解纖維素的褐腐真菌，并且分析其產(chǎn)酶特性。[方法]從腐朽木材上分離出一株褐腐真菌，分析該菌株的形態(tài)學(xué)特征、生物學(xué)特性，并且通過(guò)液體發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定該菌株的2種纖維素酶活力。[結(jié)果]該菌株為栗黑擬層孔菌。發(fā)酵試驗(yàn)表明，在初始pH 6.0、CMCNa 0.5 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、CaCl2 0.5 g/L、VB1 0.5 g/L、MgCl2 2 mmol/L、酵母粉5.0 g/L、酒石酸銨0.5 g/L的條件下，培養(yǎng)5 d時(shí)纖維素酶活力最高，內(nèi)切葡聚糖苷酶（CMCCase）為21.71 U/ml，β葡聚糖苷酶為10.69 U/ml。[結(jié)論]該試驗(yàn)為進(jìn)一步研究褐腐真菌降解木質(zhì)纖維素的機(jī)制提供前期基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 褐腐真菌；液體發(fā)酵；纖維素酶

中圖分類(lèi)號(hào) S188+.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）16-04953-03

木質(zhì)纖維原料主要由纖維素（一種葡萄糖聚合物）、半纖維素（一種戊糖和己糖聚合物）及木質(zhì)素（一種不規(guī)則苯丙醇單元聚合物）組成[1]。其中，纖維素又被稱(chēng)為“生物幣”，是地球上最古老、最豐富的可再生生物資源，并且廣泛存在于植物中[2]。有資料顯示，植物每年產(chǎn)纖維素量約為1 800億t，纖維素能夠轉(zhuǎn)化為可溶性糖、乙醇以及工業(yè)化合物等可利用產(chǎn)物[3]。從環(huán)保、高效的角度出發(fā)，纖維素被分解且無(wú)污染的一條有效途徑就是利用纖維素酶的水解，其中采用微生物發(fā)酵是最方便的方法。纖維素酶主要由內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖酶3種酶組成，而大部分微生物如細(xì)菌、放線菌和真菌等能夠產(chǎn)生纖維素酶。真菌中，已深入研究且作為水解纖維素的模式菌為軟腐菌（Trichoderma viride）和白腐菌（Phanerochaete chrysosporium），但是對(duì)褐腐菌降解纖維素的研究較少[4]。筆者從長(zhǎng)白山地區(qū)腐朽木材上分離出一株可以分解纖維素的褐腐菌。該菌株與其他63種菌株相比分解木材能力最強(qiáng)[5]，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行鑒定和優(yōu)化培養(yǎng)，以期為真菌纖維素酶的研究和應(yīng)用提供新的真菌資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源。東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林保護(hù)教研室保存菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基組成為：去皮馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂 20 g/L?；A(chǔ)培養(yǎng)基組成為：CMCNa 5 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，酵母 10 g/L，CaCl2 0.5 g/L，VB1 0.5 g/L。

1.1.3 DNS試劑的配制[6]。量取750 ml去離子水，加熱至45 ℃時(shí)加入10.00 g 3，5-二硝基水楊酸，待完全溶解后依次加入100 ml 4 mol/L NaOH、5.00 g苯酚、5.00 g Na2SO3和300.00 g酒石酸鉀鈉，溶解后定容至1 L，將棕色瓶在室溫、暗處放置7 d后使用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種鑒定。采用18rRNA ITS基因序列分析。以基因組DNA為模板，采用通用引物ITS1（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′）和ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）進(jìn)行PCR。擴(kuò)增體系為：10×PCR Buffer 2.5 μl，dNTPs（2.5 mmol/L）1 μl，上游引物（20 μmol/L）1 μl，下游引物（20 μmol/L）1 μl，rTaq酶 0.25 μl，DNA模板 0.5 μl，去離子水補(bǔ)足至25 μl。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 2 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。準(zhǔn)確稱(chēng)取100 mg葡萄糖（預(yù)先在105 ℃烘干至恒重），用去離子水溶解后定容至100 ml，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 ml，加蒸餾水定容至2 ml，再分別加入3 ml DNS試劑，混勻后沸水浴5 min，立即冷卻至室溫，加蒸餾水至25 ml，搖勻，520 nm處測(cè)吸光值，以此制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出回歸方程和回歸系數(shù)。

1.2.3 粗酶液的制備。接種4 ℃保存的試管菌于PDA平皿中，28 ℃靜止培養(yǎng)。待長(zhǎng)滿皿后用打孔器（直徑9 mm）轉(zhuǎn)接進(jìn)PDA平皿中擴(kuò)大培養(yǎng)。培養(yǎng)8 d后，取最外圍菌餅接入含100 ml產(chǎn)酶液的250 ml三角瓶中，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)。取發(fā)酵液于4 ℃下，10 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。

1.2.4 纖維素酶活力的測(cè)定。

1.2.4.1 內(nèi)切葡聚糖苷酶（CMCCase）的測(cè)定[7]。取0.5 ml粗酶液，添加1 ml濃度1%CMCNa（用pH 5.0，50 mmol/L檸檬酸緩沖液溶解CMCNa），對(duì)照不添加酶液，50 ℃條件下反應(yīng)30 min，立即加入3 ml DNS試劑，再于對(duì)照管中加入0.5 ml粗酶液，沸水浴5 min后取出，立即冷卻至室溫，定容至5 ml，于520 nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值。

1.2.4.2 β葡聚糖苷酶的測(cè)定。在離心管中加入1 ml濃度0.5%水楊苷檸檬酸緩沖液和0.5 ml酶液，50 ℃水浴30 min后取出，立即加入3 ml DNS試劑，再于對(duì)照管中加入0.5 ml粗酶液，沸水浴5 min，立即冷卻至室溫，定容至5 ml，在520 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。以上酶活力單位（U/ml）定義為：在50 ℃條件下，每毫升酶液在1 min內(nèi)催化底物生成1 μg葡萄糖所需的酶量。

1.3 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

1.3.1 不同初始pH。以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為產(chǎn)酶培養(yǎng)基，初始pH分別調(diào)節(jié)為4、5、6、7。接入5塊直徑9 mm的菌餅于含50 ml發(fā)酵液的250 ml三角瓶中，150 r/min培養(yǎng)5 d，測(cè)定CMCCase。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.2 不同發(fā)酵時(shí)間。以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為產(chǎn)酶培養(yǎng)基，接入7塊菌餅于含100 ml發(fā)酵液的250 ml三角瓶中，分別培養(yǎng)1、3、5、7和9 d，測(cè)定CMCCase、β葡聚糖苷酶酶活。

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，研究不同初始pH（A）、裝液量（B）、氮源濃度（C）和接種量（D）4個(gè)因素對(duì)酶活的影響。按L9（34）正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素、水平見(jiàn)表1。

1.3.4 不同金屬離子。在上述最佳條件下，分別添加MgCl2、ZnCl2、KCl、NaCl和MnCl2，培養(yǎng)5 d后測(cè)定CMCCase、β葡聚糖苷酶酶活。

1.3.5 不同N源。在上述最佳條件下，分別以尿素、酒石酸銨、磷酸銨、NH4NO3、（NH4）2SO4為氮源，培養(yǎng)5 d后測(cè)定CMCCase、β葡聚糖苷酶酶活。

1.3.6 不同氨基酸。以上述獲得的最佳培養(yǎng)基為產(chǎn)酶培養(yǎng)基，分別加入亮氨酸、泛氨酸、煙酸、谷氨酸、蘇氨酸，培養(yǎng)5 d后測(cè)定CMCCase、β葡聚糖苷酶酶活。

1.4 分析方法 運(yùn)用SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用Excel進(jìn)行作圖[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株ITS序列鑒定[9] 將測(cè)序結(jié)果提交到NCBI的GenBank中，得到登陸號(hào)為JX863102.1，在線進(jìn)行Blast分析，結(jié)果顯示與該褐腐菌相似性最高的菌株均屬于Fomitopsis屬，與栗生灰黑孔菌Melanoporia castanea相似性達(dá)99%。利用MEGA 5.2的NeighborJoining 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖1所示。菌株CY2012占據(jù)著一個(gè)獨(dú)立的分支，可能為一個(gè)新的亞種。

2.3.1 不同初始pH對(duì)產(chǎn)酶條件的影響。為了探索不同初始pH對(duì)褐腐菌發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶能力的影響，將菌株置于不同的pH條件下進(jìn)行發(fā)酵。由圖3可知，當(dāng)初始pH為6.0時(shí)，產(chǎn)CMCCase最高，酶活為12.62 U/ml。在pH 4.0～6.0時(shí)，隨著pH的增加，產(chǎn)酶量逐漸提高。通過(guò)顯著性分析，發(fā)現(xiàn)在pH 4.0～6.0時(shí)，差異不顯著，說(shuō)明該菌株在4～6之間有利于產(chǎn)生CMCCase；當(dāng)pH高于6.0時(shí)產(chǎn)酶量急劇下降，說(shuō)明該菌適宜在偏酸環(huán)境下生長(zhǎng)。

注：圖中不同小寫(xiě)字母表示差異在0.05水平顯著。

圖3 初始pH對(duì)產(chǎn)酶條件的影響2.3.2 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響。在不同培養(yǎng)時(shí)間，檢測(cè)CMCCase、β-葡聚糖苷酶酶活的大小。由圖4可知，在培養(yǎng)的第1天，在發(fā)酵液中已經(jīng)檢測(cè)到酶活，到第5天時(shí)產(chǎn)酶開(kāi)始顯著升高，CMCCase酶活為19 U/ml；到第9天時(shí)，酶活基本達(dá)到穩(wěn)定。β-葡聚糖苷酶在第9天時(shí)最高，酶活為6.14 U/ml。為了縮短培養(yǎng)時(shí)間，同時(shí)得到高產(chǎn)量的酶活，選取第5天為最佳產(chǎn)酶時(shí)間。

注：圖中不同小寫(xiě)字母表示差異在0.05水平顯著。

圖4 不同培養(yǎng)天數(shù)對(duì)產(chǎn)酶的影響2.3.3 正交試驗(yàn)。由于pH在4～6時(shí)差異不顯著，選取pH、裝液量、氮源濃度和接種量為研究對(duì)象，按L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，在第5天時(shí)檢測(cè)CMCCase酶活。試驗(yàn)結(jié)果及分析見(jiàn)表2。采用直觀分析法分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)第8組A3B2C1D3產(chǎn)酶量最高，酶活為18.05 U/ml。由方差分析可知，接種量、pH對(duì)褐腐菌產(chǎn)CMCCase的影響最大，酵母濃度次之，裝液量對(duì)產(chǎn)酶影響最小，從而得到最優(yōu)產(chǎn)酶組合為A3B3C1D3。

2.3.4 不同金屬離子對(duì)菌株產(chǎn)酶活力的影響。由圖5可知，MgCl2和KCl有利于產(chǎn)CMCCase酶，酶活分別為19.57、18.57 U/ml，NaCl抑制CMCCase酶的產(chǎn)生，但是有利于β-葡聚糖苷酶的產(chǎn)生。MgCl2最有利于β-葡聚糖苷酶的產(chǎn)生，酶活為6.80 U/ml。顯著性分析結(jié)果表明，ZnCl2對(duì)CMCCase酶和β-葡聚糖苷酶的產(chǎn)生量最少。

注：圖中不同小寫(xiě)字母表示差異在0.05水平顯著。

注：圖中不同小寫(xiě)字母表示差異在0.05水平顯著。

g/L，VB1 0.5 g/L，pH 6.0，每250 ml三角瓶裝100 ml發(fā)酵液，同時(shí)添加0.5 g/L MgCl2，接種7塊菌餅，添加不同的無(wú)機(jī)氮源，注：圖中不同小寫(xiě)字母表示差異在0.05水平顯著。

由圖7可知，當(dāng)添加尿素時(shí)，菌株幾乎不產(chǎn)生CMCCase酶；酒石酸銨最利于產(chǎn)（上接第4955頁(yè)）

CMCCase酶和β-葡聚糖苷酶，酶活分別為21.71、10.69 U/ml。

3 討論

通過(guò)形態(tài)鑒定、生物學(xué)分析，確定該褐腐菌為栗黑擬層孔菌（Fomitopsis sp.CY2012），在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上處于一個(gè)單獨(dú)的分支，可能是一個(gè)新的亞種。該菌株是64種腐朽菌中降解木材最高的一種。通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該菌株幾乎不產(chǎn)濾紙酶。真菌是VB1的天然缺陷型。它們以一種輔酶的形式存在，對(duì)真菌的生長(zhǎng)很重要。因此，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加VB1，有利于菌株良好的生長(zhǎng)[10]。由于該菌不像木霉一樣能夠產(chǎn)生大量的孢子，接種時(shí)以菌餅為主，且選取平皿中最外圍新生的菌絲。在優(yōu)化前，CMCCase酶活約為8 U/ml，優(yōu)化后為21.71 U/ml，提高了3倍左右。該菌產(chǎn)β葡聚糖苷酶較低，添加氨基酸后產(chǎn)量明顯增加。尿素和NaCl都會(huì)抑制CMCCase酶的產(chǎn)生，但對(duì)β-葡聚糖苷酶的產(chǎn)生無(wú)抑制作用。

近年來(lái)，對(duì)木霉發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)條件的研究很多，但是有關(guān)腐朽菌產(chǎn)纖維素酶的研究較少[11]。該研究通過(guò)對(duì)褐腐菌產(chǎn)纖維素酶液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，為進(jìn)一步研究腐朽菌降解纖維素機(jī)制提供前期基礎(chǔ)。

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責(zé)任編輯 劉月娟 責(zé)任校對(duì) 況玲玲