韓建軍+寧娜+郁建生+鄒宗堯+牟少霞

摘要： 利用響應(yīng)面分析法對(duì)川芎阿魏酸的微波協(xié)同酶法提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取纖維素酶用量、酶解溫度、酶解pH值以及酶解時(shí)間進(jìn)行了4因素3水平的Box-Behnken中心組合研究，通過(guò)響應(yīng)面分析法對(duì)提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定微波協(xié)同酶法提取川芎中阿魏酸的最佳工藝。試驗(yàn)結(jié)果表明：最佳酶解條件為纖維素酶用量3.6 mg/g、酶解pH值4.6、酶解時(shí)間52 min、酶解溫度53 ℃，在該條件下，川芎阿魏酸的提取得率為89.18%。

關(guān)鍵詞： 川芎；阿魏酸；纖維素酶；微波法；響應(yīng)面；提?。粌?yōu)化

中圖分類(lèi)號(hào)： R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）03-0284-04

川芎為傘形科植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根莖，臨床上用于治療跌撲腫痛、月經(jīng)不調(diào)等[1]。川芎含有揮發(fā)油類(lèi)[2]、多糖類(lèi)[3]、酚酸類(lèi)[4]等多種化學(xué)成分，其中阿魏酸是川芎藥材的質(zhì)控成分[1]。體內(nèi)藥理試驗(yàn)研究表明，阿魏酸具有抗菌[5]、抗抑郁[6]、降壓[7]等活性。

目前已報(bào)道的川芎中阿魏酸的提取方法主要有微波法[8]、回流法[9]、超高壓提取法[10]等。其中微波法是通過(guò)微波能加熱與藥材相接觸的溶劑，將目標(biāo)成分從藥材中轉(zhuǎn)移至溶劑中的一個(gè)過(guò)程，具有高效、節(jié)能、污染低的特點(diǎn)[11]。生物酶解技術(shù)通過(guò)酶解作用可使植物細(xì)胞壁疏松、破裂，從而降低傳質(zhì)阻力，促進(jìn)有效成分的溶出，提高有效成分提取率，因而被越來(lái)越多地用于中藥有效成分的提取中[12]。本研究采用微波協(xié)同酶法提取川芎中阿魏酸，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化酶解條件，以期為川芎中阿魏酸的開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

川芎，購(gòu)買(mǎi)于重慶市中藥材市場(chǎng)，經(jīng)銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院梁玉勇教授鑒定為川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）；阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；纖維素酶，購(gòu)自天津利華酶制劑技術(shù)有限公司，酶活力為10 000 U/g；水為重蒸水；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

儀器：LC-20AT高效液相色譜儀（自動(dòng)進(jìn)樣器、在線(xiàn)脫氣機(jī)、二元泵、DAD檢測(cè)器和LC-solution 色譜工作站，日本島津公司）；LWMC-201型微波化學(xué)反應(yīng)器（南京旋光科技有限公司）；AB-135S十萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)梅特勒公司）；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；PHS-25型酸度計(jì)（杭州亞美電子儀器廠）；KS-600D 超聲清洗機(jī)（寧波科生儀器廠）；電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永鑫實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備廠）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 阿魏酸的含量測(cè)定

1.2.1.1 色譜條件[1] Kromasil-C18柱（5 μm，4.6 mm×150.0 mm）；流動(dòng)相：甲醇-1%乙酸溶液（體積比30 ∶ 70）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：321 nm；進(jìn)樣量：10 μL。該色譜條件下理論塔板數(shù)以阿魏酸峰計(jì)算不低于4 000，該色譜條件下測(cè)定阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品及川芎藥材得到的色譜結(jié)果見(jiàn)圖1。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 精確稱(chēng)取10.5 mg阿魏酸對(duì)照品置于25 mL棕色容量瓶中，并用70%甲醇定容，搖勻，得042 mg/mL阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確移取0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 mL阿魏酸對(duì)照品溶液至10 mL棕色容量瓶中，并用70%甲醇定容。精確吸取所配制的不同濃度的對(duì)照品溶液各10 μL注入液相色譜儀，按照“1.2.1.1”節(jié)中的色譜條件測(cè)定峰面積，并以峰面積為縱坐標(biāo)（y）、進(jìn)樣量（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：y=5 312x-1.034，r=0.999 9，線(xiàn)性范圍：0.042～0.420 μg。

1.2.1.3 阿魏酸含量的測(cè)定 取經(jīng)干燥至恒質(zhì)量的浸膏適量置于10 mL棕色容量瓶中，并用70%甲醇溶解，所得溶液用0.45 μm 的微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液10 μL按照“1.2.1.1”節(jié)的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，并根據(jù)峰面積計(jì)算阿魏酸的提取得率。阿魏酸提取得率按照如下公式進(jìn)行計(jì)算：

阿魏酸提取得率=[提取得到的阿魏酸含量（g）/川芎藥材中阿魏酸的含量（g）]×100%。

1.2.2 川芎中阿魏酸的提取工藝流程 川芎中阿魏酸的提取工藝流程：川芎→干燥、粉碎成粗粉（過(guò)24目篩）→酶解→微波提取→合并提取液→減壓回收溶劑→浸膏→干燥至恒質(zhì)量→測(cè)定阿魏酸含量，并計(jì)算阿魏酸提取得率。其中微波提取條件的工藝參數(shù)為：8倍量的50%乙醇、微波功率為150 W、提取次數(shù)為2次、提取時(shí)間為2 min/次。

1.3 酶解條件的單因素試驗(yàn)

1.3.1 纖維素酶用量對(duì)阿魏酸提取率的影響 準(zhǔn)確稱(chēng)取 10 g 川芎粗粉置于裝有100 mL蒸餾水的錐形瓶中，在酶解溫度為50 ℃、酶解pH值為4.5、酶解時(shí)間為60 min的條件下，考察不同纖維素酶用量（1、2、3、4、5 mg/g）對(duì)阿魏酸提取率的影響。

1.3.2 酶解時(shí)間對(duì)阿魏酸提取率的影響 準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g川芎粗粉置于裝有100 mL蒸餾水的錐形瓶中，在酶解pH值為4.5、纖維素酶用量為3 mg/g、酶解溫度為50 ℃的條件下，考察不同酶解時(shí)間（30、40、50、60、70 min）對(duì)阿魏酸提取率的影響。

1.3.3 酶解pH值對(duì)阿魏酸提取率的影響 準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g川芎粗粉置于裝有100 mL蒸餾水的錐形瓶中，在纖維素酶用量為3 mg/g、酶解溫度為50 ℃、酶解時(shí)間為60 min的條件下，考察不同酶解pH值（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5）對(duì)阿魏酸提取率的影響。

1.3.4 酶解溫度對(duì)阿魏酸提取率的影響 準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g川芎粗粉置于裝有100 mL蒸餾水的錐形瓶中，在纖維素酶用量為3 mg/g、酶解pH值為4.5、酶解時(shí)間為60 min的條件下，考察不同酶解溫度（35、40、45、50、55 ℃）對(duì)阿魏酸提取率的影響。

1.4 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以阿魏酸的提取得率為響應(yīng)值，用Design-Expert 8.0軟件的Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理對(duì)所選變量進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，預(yù)測(cè)微波協(xié)同酶法提取川芎中阿魏酸的最佳工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解川芎藥材的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 纖維素酶用量對(duì)川芎中阿魏酸提取得率的影響 由圖2可知，酶用量在1～3 mg/g時(shí)，阿魏酸提取率隨著酶用量的增加而明顯升高；當(dāng)纖維素酶用量繼續(xù)增加時(shí)，阿魏酸提取得率增加緩慢。因此，纖維素酶用量宜選在3 mg/g左右。

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)川芎中阿魏酸提取得率的影響 由圖3可知，阿魏酸提取得率隨著酶解時(shí)間的增加而升高；當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)50 min后，阿魏酸提取得率增加趨于平緩。因此，酶解時(shí)間宜選擇在50 min左右。

2.1.3 酶解pH值對(duì)川芎中阿魏酸提取得率的影響 由圖4可知，當(dāng)酶解pH值為4.5時(shí)，阿魏酸提取得率最高。由于pH值過(guò)低或者過(guò)高都會(huì)影響纖維素酶活力，最終影響有效成分的提取，因此最佳酶解pH值選在4.5左右。

2.1.4 酶解溫度對(duì)川芎中阿魏酸提取得率的影響 由圖5可知，在酶解溫度為35～50 ℃時(shí)，阿魏酸提取得率隨著酶解溫度的升高而增加；當(dāng)酶解溫度超過(guò)50 ℃時(shí)，阿魏酸提取得率有所下降，這是由于隨著溫度的不斷升高，纖維素酶活性不斷增強(qiáng)，但是當(dāng)溫度過(guò)高即超過(guò)了纖維素酶的最適溫度時(shí)，則會(huì)引起纖維素酶失活。因此，酶解溫度宜選擇在50 ℃左右。

2.2 川芎阿魏酸提取工藝響應(yīng)面法優(yōu)化分析

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，以纖維素酶用量（X1）、酶解時(shí)間（X2）、酶解pH值（X3）和酶解溫度（X4）4個(gè)因素為變量，以阿魏酸提取得率（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理進(jìn)行4因素3水平試驗(yàn)。具體的試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1，響應(yīng)面分析方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

由Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合得到的二元多項(xiàng)回歸方程為：Y=88.16+3.17X1+1.95X2+3.38X3+1.99X4+0.28X1X2-0.65X1X3+1.44X1X4-3.30X2X3+1.23X2X4-0.41X3X4-3.00X12-3.56X22-4.54X32-5.45X42。

該模型回歸方程的方差分析結(jié)果見(jiàn)表3，可以看出，模型極顯著（P<0.000 1），失擬項(xiàng)（P=0.053）不顯著，表明回歸方程擬合度和可信度較高、試驗(yàn)誤差較小，可用于指導(dǎo)阿魏酸提取試驗(yàn)設(shè)計(jì)。模型中R2為0.991 2，RAdj2為 0.982 4，表明響應(yīng)值98.24%的變化來(lái)源于所選變量；模型的變異系數(shù)為0.83%（<10%），表明試驗(yàn)有良好的穩(wěn)定性；模型的信噪比為34.315（>4），表明該模型適用于川芎阿魏酸提取工藝的優(yōu)化。該回歸方程中的一次項(xiàng)中，X3對(duì)阿魏酸提取得率的影響顯著，X1、X2、X4對(duì)阿魏酸提取得率的影響極顯著；交互項(xiàng)中X1X4、X2X3、X2X4對(duì)阿魏酸提取得率的影響極顯著；二次項(xiàng)中X12、X22、X32、X42均對(duì)阿魏酸提取得率的影響極顯著。根據(jù)回歸方程中的各項(xiàng)系數(shù)及表3中回歸方程結(jié)果可知，在所選因素范圍內(nèi)，各個(gè)因素對(duì)阿魏酸提取得率的影響順序?yàn)椋好附鈖H值>纖維素酶用量>酶解溫度> 酶解時(shí)間。

所考察的4個(gè)因素（纖維素酶用量、酶解時(shí)間、酶解pH值和酶解溫度）兩兩交互作用對(duì)川芎中阿魏酸提取得率的影響見(jiàn)圖6，響應(yīng)曲面的坡度越陡峭，則表明因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著。由圖6可以看出，在所選的4個(gè)因素的交互作用中，酶解溫度與纖維素酶用量的交互作用、酶解pH值與酶解時(shí)間的交互作用以及酶解時(shí)間與酶解溫度的交互作用均對(duì)川芎中阿魏酸的提取得率有顯著影響，其中以酶解pH值與酶解時(shí)間的交互作用對(duì)阿魏酸提取得率的影響最為顯著。以上對(duì)響應(yīng)面圖的分析結(jié)果與表3的分析結(jié)果一致。

經(jīng)過(guò)Design Expert 8.0.6軟件的分析，得到川芎中阿魏酸酶解的最佳工藝條件為：纖維素酶用量3.58 mg/g、酶解時(shí)間52.35 min、酶解pH值4.62、酶解溫度52.77 ℃，在此條件下，阿魏酸理論提取的得率為89.97%。為驗(yàn)證方法的可行性，采用上述酶解條件對(duì)川芎進(jìn)行微波-酶法提取阿魏酸的試驗(yàn)，為方便操作，將上述優(yōu)化的條件調(diào)整為纖維素酶用量3.6 mg/g、酶解時(shí)間52 min、酶解pH值4.6、酶解溫度53 ℃，在優(yōu)化條件下做3組平行試驗(yàn)，測(cè)得阿魏酸平均提取率為89.18%，試驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)相對(duì)誤差僅為0.88%。

3 結(jié)論

本研究以川芎中阿魏酸提取得率為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)纖維素酶用量、酶解時(shí)間、酶解pH值以及酶解溫度進(jìn)行了考察。在此基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)而建立了數(shù)學(xué)模型，得到優(yōu)化的酶解處理川芎藥材的工藝條件，即纖維素酶用量為3.6 mg/g、酶解時(shí)間為52 min、酶解pH值為4.6、酶解溫度為53 ℃，在該條件下川芎中阿魏酸的提取率達(dá)到89.18%。

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