低濃度秋水仙素離體誘導(dǎo)甜葉菊多倍體技術(shù)體系的建立

彭程等

摘 要 以甜葉菊莖段為外植體，采用不同低濃度秋水仙素在甜葉菊試管苗莖段再生苗初期進(jìn)行長時間持續(xù)處理，以探討低濃度秋水仙素誘導(dǎo)甜葉菊多倍體的優(yōu)勢及適合長時間誘導(dǎo)甜葉菊的秋水仙素濃度，簡化甜葉菊離體誘導(dǎo)多倍體技術(shù)環(huán)節(jié)。結(jié)果表明：0.025%的秋水仙素濃度適合于甜葉菊多倍體離體誘導(dǎo)的持續(xù)誘變，直至試管苗再生而無需清洗外植體和更換培養(yǎng)基，簡化了誘導(dǎo)技術(shù)環(huán)節(jié)，提高了甜葉菊多倍體離體誘導(dǎo)效率；多倍體植株田間農(nóng)藝性狀表現(xiàn)為葉片大而厚實(shí)、開花延遲、花蕾較大等特征。旨在建立低濃度秋水仙素離體誘導(dǎo)甜葉菊多倍體技術(shù)體系。

關(guān)鍵詞 甜葉菊；低濃度秋水仙素；多倍體

中圖分類號 Q949.783.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Establishment of the Technique System of Polyploidy

Induction for Stevia rebaudiana Bertoni by Low

Concentration of Colchicines in vitro

PENG Cheng， ZHANG Lulu*， YE Chao， SHE Qingmei， YANG Chenglin，

ZHOU Mingliang， MA Xiangxiang， ZHAO Yang， CUI Guangrong**

Plant Science School/Anhui Science and Technology University， Fengyang， Anhui 233100， China

Abstract The stem sections of S. rebaudiana Bertoni were used as explants for polyploidy induction in vitro by low concentrations of colchicines for long time treatments during shoot formation. The aims were to study the superiority of polyploidy induction by lower concentrations of colchicines for long time in S. rebaudiana Bertoni and simplify the technique protocols for polyploidy induction in vitro in S. rebaudiana Bertoni. The results showed that the concentration of 0.025% colchicines was suitable to induct polyploidy in vitro for long time treatment and need not rinse explants， change medium until the shoots formation. Agricultural traits of the polyploidy displayed bigger and thicker leaves， bigger flower bud and florescence being postponed. The technique system of polyploidy induction for S. rebaudiana Bertoni was established by low concentration of colchicines in vitro.

Key words Stevia rebaudiana Bertoni；Low concentration of colchicines；Polyploidy

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.011

甜葉菊（Stevia rebaudiana bertoni）是菊科多年生草本植物，原產(chǎn)于南美巴拉圭，現(xiàn)世界各地引種栽培均獲得成功。甜葉菊是一種新型糖源植物，它所含有的甜菊糖甙的甜度是蔗糖的250～300倍，但所含熱量只是蔗糖的1/300[1-4]。利用秋水仙素開展多倍體誘導(dǎo)是植物倍性育種的常用技術(shù)之一，將植物組織培養(yǎng)技術(shù)與化學(xué)誘變技術(shù)結(jié)合起來是開展誘變育種的一個重要發(fā)展方向，現(xiàn)已有相關(guān)成功的報(bào)道[5-8]和較多的優(yōu)點(diǎn)。國內(nèi)有關(guān)甜葉菊多倍體離體誘導(dǎo)報(bào)道僅見王波等[5]、李紅楊等[6]2例報(bào)道，并且已取得了十分相似的、較好的試驗(yàn)結(jié)果，這表明在離體條件下利用秋水仙素誘導(dǎo)甜葉菊多倍體具有較好的穩(wěn)定性。但上述試驗(yàn)中也存在一些不足，即在化學(xué)藥劑處理后需要清洗外植體、更換培養(yǎng)基等試驗(yàn)環(huán)節(jié)，既浪費(fèi)人力物力，又容易造成材料污染，而且誘變效率低等[5-6]。在相關(guān)研究的基礎(chǔ)上[5]，本試驗(yàn)擬采用低劑量秋水仙素處理，以探討離體條件下持續(xù)誘導(dǎo)甜葉菊多倍體技術(shù)，省去清洗外植體、更換培養(yǎng)基等技術(shù)環(huán)節(jié)，簡化了誘導(dǎo)程序，提高了誘變效率，旨在建立一種簡單、方便的甜葉菊多倍體誘導(dǎo)技術(shù)體系，為甜葉菊多倍體育種奠定基礎(chǔ)，同時為其他植物的倍性育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

在超凈工作臺上取出試管苗除去葉片，剪成約1 cm長含側(cè)芽莖段，水平放置于再生培養(yǎng)基表面上，輕按固定，每瓶接種5個莖段，每個處理接種10瓶，最后置于培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，其培養(yǎng)方法參照王波等[5]的方法。培養(yǎng)2 d后取出，在超凈工作臺上分別滴加0.10%、0.05%、0.025%、0.012 5%、0.006 25%秋水仙素（過濾滅菌），確保秋水仙素浸潤每個莖段，并以滴加無菌水的設(shè)為空白對照。秋水仙素處理完畢放回培養(yǎng)室，繼續(xù)培養(yǎng)芽苗長至2.0 cm高時（約30 d），在超凈工作臺上將芽苗剪下接種于生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d。觀察莖段側(cè)芽的生長變化、試管苗生根等情況，統(tǒng)計(jì)誘變苗再生率（再生率=再生苗莖段數(shù)/接種莖段總數(shù)×100%，污染瓶苗不計(jì)）。

多倍體試管苗的鑒定參照王波等[5]的方法（誘變率=多倍體苗數(shù)/再生苗總數(shù)×100%，污染瓶苗不計(jì)）。將誘變苗移栽至大田中觀察農(nóng)藝性狀，并與對應(yīng)的二倍體進(jìn)行比較。試驗(yàn)于2011年12月至2012年10月在安徽科技學(xué)院遺傳育種實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。離體誘變試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析比較，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度秋水仙素處理對不同品系甜葉菊莖段側(cè)芽再生苗的影響

由表1可知，不同濃度秋水仙素處理嚴(yán)重抑制了莖段側(cè)芽的萌發(fā)，濃度越大，抑制效應(yīng)越強(qiáng)烈，各品系表現(xiàn)基本一致；并且對后期再生芽苗的生長產(chǎn)生較強(qiáng)的傷害作用，試管苗表現(xiàn)出初期生長緩慢，部分芽苗呈現(xiàn)出一定的畸形狀（圖1），這些傷害作用在較高濃度（0.10%處理）下尤為明顯。從芽苗再生率情況看，同品系、不同濃度處理間差異顯著，不同品系間也存在著一定的差異，其中+3品系在各種濃度處理下苗再生率均低于其他品系，而ST品系的苗再生率則均高于其他品系，反映出甜葉菊不同品系對秋水仙素的敏感性不盡相同。

2.2 不同濃度秋水仙素處理對不同品系甜葉菊再生苗誘變率的影響

由表2可知，不同濃度的秋水仙素處理，再生苗多倍體的比例差異較大，其總體趨勢是隨著秋水仙素濃度不斷減小，多倍體的誘導(dǎo)率不斷下降，各品系表現(xiàn)基本一致，呈現(xiàn)出秋水仙素誘導(dǎo)多倍體時的共性特征。但在本試驗(yàn)中，秋水仙素濃度在0.10%～0.025%的范圍內(nèi)，多倍體誘導(dǎo)率變化不大，幾乎無差異；當(dāng)秋水仙素濃度降至0.012 5%以下時，多倍體誘導(dǎo)率急劇下降，呈現(xiàn)出倍性減少的趨勢，多倍體誘導(dǎo)效應(yīng)迅速減弱，各品系均呈現(xiàn)出類似的效應(yīng)。此外，不同品系甜葉菊在相同的誘導(dǎo)條件下，多倍體誘變率也表現(xiàn)出一定的差異，體現(xiàn)出多倍體誘導(dǎo)中基因型間的差異（表2）。

結(jié)合2.1與2.2的結(jié)果不難看出，在秋水仙素濃度為0.025%時，不僅維持了甜葉菊芽苗較高的再生頻率，而且保證了多倍體較高的誘變頻率；秋水仙素濃度高于0.025%時，雖然能夠獲得更高的誘變率，但獲得的再生苗數(shù)少，獲得多倍體苗數(shù)相應(yīng)較少；而秋水仙素濃度低于0.025%時，雖能獲得較多的再生苗數(shù)，但多倍體比例較低。綜合二者因素，在甜葉菊試管苗莖段側(cè)芽再生苗過程中，采用較低劑量的0.025%秋水仙素持續(xù)處理，能夠獲取較多數(shù)量的多倍體試管苗，從而有效提高了誘變效率。

2.3 不同品系甜葉菊多倍體試管苗生根、移栽及農(nóng)藝性狀差異

試驗(yàn)結(jié)果顯示，多倍體與二倍體試管苗在后期生根成苗后，外部形態(tài)上并無明顯的區(qū)別，但在生根率及生根數(shù)量上則存在一定的差異。由表3可知，多倍體苗生根率普遍較二倍體苗低，且生根數(shù)量較少，一般二倍體生根數(shù)量為6～8根，而多倍體的生根數(shù)量一般為3～5根，進(jìn)而影響其移栽成活率。

與試管苗表現(xiàn)不同，多倍體植株田間的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)與二倍體間差異極為明顯。對各品系多倍體植株進(jìn)行初步的田間農(nóng)藝性狀考察，結(jié)果顯示，多倍體植株生長較為緩慢，株高矮10 cm左右，花期普遍晚10～15 d，葉片大而厚實(shí)，葉色較淺（圖2），花蕾較大（圖3）。除株高與一般植物多倍體特性存在偏差外，其他特征均表現(xiàn)出一般多倍體的共同特征，其原因有待于進(jìn)一步研究。

3 討論與結(jié)論

在植物多倍體離體誘導(dǎo)中，通常采用特定濃度的秋水仙素結(jié)合特定的時間進(jìn)行處理，從而確定效率較高的處理劑量，較高的濃度和較長的處理時間均會對材料產(chǎn)生較大的損傷[5-8]，因而影響誘變工作效率。在此過程中需要清洗處理材料、更換培養(yǎng)基等環(huán)節(jié)，既浪費(fèi)人力物力又易造成培養(yǎng)材料的污染，誘變效率較低[5-6]。與前人相關(guān)研究進(jìn)行比較，本試驗(yàn)采用的低濃度秋水仙素、長時間持續(xù)誘變處理，去除了試驗(yàn)過程中對材料清洗、更換培養(yǎng)基等環(huán)節(jié)，極大地提高了誘變效率，也為其他植物的離體化學(xué)誘變提供了有益的參考。

多倍體植株一般表現(xiàn)為形態(tài)上的巨大性、細(xì)胞內(nèi)次生代謝物含量高等特點(diǎn)，甜菜等植物多倍體品種在生產(chǎn)上已經(jīng)獲得了廣泛應(yīng)用。本研究結(jié)果顯示，甜葉菊多倍體在一定程度上表現(xiàn)了器官的巨大性，如葉片、花蕾等，但植株整體并未能表現(xiàn)出巨大性，尤其是生物學(xué)產(chǎn)量偏低，其原因尚待繼續(xù)研究。甜葉菊是以葉片為主要收獲產(chǎn)品，其葉片的巨大性已經(jīng)顯示了倍性育種的潛力，但要形成生產(chǎn)上能夠廣泛應(yīng)用的多倍體品種尚有較多的問題需解決。

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