冷青云等

摘 要 以紅掌品種‘櫻桃紅正常株及其疑似變異株為試驗(yàn)材料，采用形態(tài)學(xué)特征比較、流式細(xì)胞儀檢測(cè)及染色體計(jì)數(shù)法對(duì)其進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明： 疑似變異株與正常株在葉片寬度、葉片長(zhǎng)度/葉片寬度、葉片厚度、葉柄長(zhǎng)度、葉柄粗細(xì)、花梗粗細(xì)、佛焰苞厚度方面差異顯著，疑似變異株的氣孔長(zhǎng)度和花粉粒直徑顯著高于正常株，氣孔密度顯著低于正常株；疑似變異株的葉片單細(xì)胞DNA含量是正常株的2倍，根尖細(xì)胞染色體數(shù)目為2n=4x=60，為正常株2n=2x=30的2倍。結(jié)果證實(shí)了該疑似變異株為四倍體，是作為研究紅掌的遺傳變異和進(jìn)行多倍體育種的較好材料。

關(guān)鍵詞 紅掌品種‘櫻桃紅；變異株；多倍體鑒定

中圖分類號(hào) S682.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The morphology， flow cytometric analysis and chromosome counting were used to identify the suspected polyploid in Anthurium andraeanum‘Cherry red. The results showed that： comparing with the normal diploid plants， the variant showed significant differences on the morphological indicators of leaf width， leaf length/width， leaf thickness， petiole length， pedicel thick coarse and spathe thickness.， the stomatal length and pollen diameter were increased， and the stomatal density was decreased significantly. Both the DNA content and chromosome number（2n=4x=60）were twice of that diploid plants. These results showed that the tested suspected variant was a tetraploid plant， which provides a novel material for the research of Anthurium genetic variation and ploidy breeding.

Key word Anthurium andraeanum‘Cherry Red； Variant； Polyploid identification

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.007

染色體加倍是真核生物（尤其是有花植物）進(jìn)化的主要原動(dòng)力[1]，也是植物育種的重要手段[2]。多倍體常常表現(xiàn)莖粗、葉厚、花瓣變厚、變多，抗性改變以及育性恢復(fù)等[3-5]，因此，多倍體材料在研究物種的遺傳進(jìn)化以及新品種培育中具有重要的利用價(jià)值。多倍體鑒定的方法主要有形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化指標(biāo)鑒定、細(xì)胞學(xué)鑒定、流式細(xì)胞儀鑒定和染色體計(jì)數(shù)等，各種鑒定方法經(jīng)常綜合應(yīng)用，相互印證。目前在白掌、月季、山茶、文心蘭、鶴頂蘭[2，6-10]等觀賞植物中通過人工誘導(dǎo)和鑒定，獲得多倍體種質(zhì)。

紅掌（Anthurium andraeanum）是世界重要的切花和盆花。目前紅掌育種方法主要采用雜交育種，染色體加倍技術(shù)也有一些報(bào)道，紅掌品種‘Pink Champion、‘Tropical、‘Arizona等通過人工誘導(dǎo)和鑒定獲得了同源四倍體植株[11-12]，少數(shù)多倍體紅掌新品種已經(jīng)被選育和應(yīng)用。要選育出更多的多倍體紅掌新品種需要一定的紅掌多倍體親本材料，而對(duì)紅掌倍性的鑒定是比較重要的步驟。在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所紅掌種質(zhì)資源圃中發(fā)現(xiàn)一株紅掌品種‘櫻桃紅（‘Cherry Red）疑似倍性變異株，與正常株相比，該植株粗壯、葉片短圓、肉穗花序短粗，具有多倍體的形態(tài)特征。本研究以該疑似變異株和正常株為試驗(yàn)材料，采用形態(tài)學(xué)特征比較、流式細(xì)胞儀檢測(cè)及染色體計(jì)數(shù)法對(duì)其進(jìn)行鑒定，旨在建立紅掌多倍體鑒定技術(shù)體系，確定其倍性水平，為紅掌多倍體育種奠定技術(shù)和材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所種植的紅掌品種‘櫻桃紅疑似變異株及正常株。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)特征比較 外觀形態(tài)特征比較：取正常植株與變異株，按花燭屬DUS測(cè)試指南[13]來測(cè)量葉片長(zhǎng)度、葉片寬度、葉柄長(zhǎng)度、花梗長(zhǎng)度、花梗粗細(xì)、佛焰苞長(zhǎng)度、佛焰苞寬度、肉穗花序長(zhǎng)度、肉穗花序粗細(xì)。葉片厚度、葉柄粗細(xì)、佛焰苞厚度用游標(biāo)卡尺測(cè)量。

葉片氣孔大小和密度比較：取正常植株與變異株完全展開的成熟葉片，在葉片下表皮均勻涂上一層透明指甲油，待指甲油干后，用鑷子挑取其表皮置于有蒸餾水的載玻片上，吸取多余的水分，加蓋玻片后在Leica DM2500生物顯微鏡下觀察測(cè)量。每片至少觀察10個(gè)視野，記錄每個(gè)視野內(nèi)氣孔器的個(gè)數(shù)，每個(gè)片選取30個(gè)氣孔，測(cè)量每個(gè)氣孔器的長(zhǎng)度和寬度。

花粉粒大小比較：取成熟花粉粒置于載玻片上，滴一滴醋酸洋紅后加蓋玻片在Leica DM2500生物顯微鏡下測(cè)量。每制片取30個(gè)花粉粒，測(cè)量其直徑。

1.2.2 倍性檢測(cè) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)：取正常植株與變異株未完全展開的嫩葉0.10 g，置于含1 mL WPB緩沖液（0.2 mol/L Tris-HCl，86 mmol/L NaCl，10 mmol/L 焦亞硫酸鈉，4 mmol/L MgCl2-6H2O，2 mmol/L EDTA-Na2·2H2O，1% PVP-10，1%（V/V）Triton X-100，pH7.5）[14]的培養(yǎng)皿中用刀片剁碎，2 min后用300目尼龍網(wǎng)過濾，濾液加入50 μL 10 mg/mL DAPI，5 min后上機(jī)檢測(cè)，儀器為美國(guó)貝克曼公司的Cell Lab Quanta SC，軟件為儀器自帶，設(shè)置正常植株在200通道。

染色體觀察：按朱澂[15]的方法，取成熟植株新長(zhǎng)出的根尖，沖洗干凈后，用飽和的對(duì)二氯苯溶液于4 ℃冰箱中預(yù)處理3～5 h，蒸餾水洗2～3次，后用卡諾固定液（95%乙醇 ∶ 冰乙酸=3 ∶ 1）于4 ℃固定4～20 h，1 mol/L鹽酸于60 ℃解離2～3 min，改良的石炭酸品紅染色壓片。Leica DM2500生物顯微鏡鏡檢拍照并統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)目。

1.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

采用Excel和dps 8.1統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅掌品種‘櫻桃紅變異株與正常株的形態(tài)學(xué)特征比較

紅掌品種‘櫻桃紅的變異株與正常株相比，植株松散（圖1-A），葉片短圓（圖1-B）、佛焰苞也更短圓及更有光澤（圖1-C）；花不高于葉片。對(duì)兩者器官的形態(tài)學(xué)特征比較結(jié)果如表1所示：變異株在葉片長(zhǎng)度、葉片寬度、葉片厚度、葉柄長(zhǎng)度等性狀上都高于正常株，葉片長(zhǎng)度/寬度小于正常株。其中葉片寬度、葉片長(zhǎng)度/寬度、葉片厚度、葉柄長(zhǎng)度、葉柄粗細(xì)差異顯著。花梗長(zhǎng)度、佛焰苞長(zhǎng)度、佛焰苞長(zhǎng)度/寬度、肉穗花序長(zhǎng)度低于正常株，但差異不顯著，花柄粗細(xì)、佛焰苞寬度、佛焰苞厚度、肉穗花序粗細(xì)高于正常株，其中花柄粗細(xì)、佛焰苞厚度差異顯著。

紅掌品種‘櫻桃紅變異株與正常株的氣孔比較見圖2，花粉粒比較見圖3。從表2可見，變異株氣孔長(zhǎng)度和寬度為36.44 μm和22.13 μm，大于二倍體氣孔的長(zhǎng)度（29.33 μm）和寬度（21.38 μm）。經(jīng)方差分析比較，二者氣孔長(zhǎng)度存在顯著差異，氣孔寬度差異不顯著。變異株單位面積氣孔數(shù)為55.50個(gè)，顯著低于二倍體植株單位面積的氣孔數(shù)。變異株的花粉粒直徑為27.08 μm，顯著大于二倍體花粉粒直徑。

2.2 紅掌品種‘櫻桃紅變異株與正常株的染色體分析

由葉片單細(xì)胞DNA含量分布（圖4）可以看出，變異株的峰值在熒光強(qiáng)度為400通道的位置，二倍體植株的峰值在熒光強(qiáng)度為200通道的位置，這說明變異株葉片單細(xì)胞DNA含量是二倍體的2倍。

對(duì)變異株和正常二倍體植株根尖染色體制片發(fā)現(xiàn)，對(duì)照二倍體根尖細(xì)胞染色體數(shù)為2n=2x=30（圖5-G1）；變異株2n=4x=60（圖5-G2）。變異株根尖細(xì)胞染色體數(shù)目為二倍體植株的2倍?？梢源_定該變異株為四倍體。

3 討論與結(jié)論

植物多倍體的形成有自然發(fā)生和人工誘導(dǎo)兩種方式。自然發(fā)生常見的途徑有植物受內(nèi)外因素變化的影響，孢母細(xì)胞在減數(shù)分裂過程中產(chǎn)生未減數(shù)配子，未減數(shù)配子受精結(jié)合，使染色體加倍[16]；或者生長(zhǎng)點(diǎn)體細(xì)胞突變形成多倍體。自然發(fā)生多倍體在植物界普遍發(fā)生，并在植物有性多倍化中起到非常重要的作用，但該發(fā)生方式頻率較低[17-18]。人工誘導(dǎo)途徑是指在人為條件下，利用物理、化學(xué)等方法誘導(dǎo)產(chǎn)生未減數(shù)配子和生長(zhǎng)點(diǎn)突變產(chǎn)生多倍體，或者利用體細(xì)胞雜交、胚乳培養(yǎng)、不同倍性雜交等生物學(xué)途徑產(chǎn)生多倍體[19]。本試驗(yàn)材料為田間發(fā)現(xiàn)的變異株，這可能是在紅掌種苗生產(chǎn)過程中，由于培養(yǎng)激素的累積，或者生長(zhǎng)點(diǎn)由于切割的原因，產(chǎn)生機(jī)械損傷，分生組織細(xì)胞有絲分裂異常，導(dǎo)致體細(xì)胞染色體加倍，經(jīng)過多次的增殖與分化后，形成多倍體植株。這是人工誘導(dǎo)產(chǎn)生多倍體的方式之一。 相較于二倍體來說，多倍體在植株外部形態(tài)上會(huì)有所改變，如葉片變短圓、厚度增加、葉色加深、花瓣變厚、氣孔變大、氣孔密度降低、花粉粒變大等[3-4，20]。外部形態(tài)的變化可以作為初步鑒定多倍體的方法，棗樹、狼尾草、紫薇、泡桐、楊樹等多倍體植株的鑒定，形態(tài)學(xué)特征和氣孔指數(shù)就作為一個(gè)鑒定指標(biāo)[21-25]。本試驗(yàn)結(jié)果亦表明紅掌品種‘櫻桃紅的多倍體與二倍體相比，植株形態(tài)差別較大，可以作為篩選多倍體的重要參數(shù)，與張志勝等[11]對(duì)人工誘導(dǎo)紅掌多倍體植株的研究結(jié)果一致。

但是單靠形態(tài)上的參數(shù)來確定植物倍性是不夠準(zhǔn)確的，需要進(jìn)一步倍性鑒定，流式細(xì)胞儀檢測(cè)和染色體計(jì)數(shù)法是植株倍性水平直接可靠的方法。Zhang等[23]對(duì)紫薇多倍體鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)形態(tài)特征初篩出的多倍體疑似植株經(jīng)過流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)僅有50%為四倍體，其他為混倍體，李豆豆等[10]對(duì)人工誘導(dǎo)鶴頂蘭多倍體鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)，部分變異植株在外部形態(tài)上發(fā)生變化，經(jīng)染色體鑒定后為嵌合體。本研究對(duì)紅掌品種‘櫻桃紅疑似變異株進(jìn)行經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)和染色體計(jì)數(shù)確定為四倍體，未發(fā)現(xiàn)混倍體的存在。因此，本研究通過植株外部形態(tài)進(jìn)行初篩，選出疑似多倍體，進(jìn)一步通過流式細(xì)胞儀和染色體計(jì)數(shù)法確定其倍性，這對(duì)于紅掌進(jìn)行多倍體鑒定是可行的，為紅掌多倍體育種后代倍性鑒定提供了可靠的方法。

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