閆洪波等

摘要 [目的]研究偏腫革裥菌Lgmnp1基因的克隆及表達情況。[方法]根據(jù)白腐菌錳過氧化物酶（MnP）基因保守序列設計引物，采用PCR、RACE及染色體步移等方法，克隆偏腫革裥菌Lenzites gibbosa CB1的全長MnP1基因（GenBank登錄號JQ327834 ），進行蛋白序列分析，并通過雙酶切的方法獲得重組質粒，將該重組質粒電轉化至巴斯德畢赤酵母中進行異源表達。[結果]獲得偏腫革裥菌Lenzites gibbosa CB1的全長MnP1基因，命名為Lgmnp1。蛋白序列分析表明LgMnP1含有4個二硫鍵屬于短MnP，預測成熟蛋白分子量為35.94 kD，pI為4.43。通過雙酶切的方法將Lgmnp1的開放閱讀框（ORF）序列連接到pPICZB載體上，獲得重組質粒pPICZB/Lgmnp1，轉化子經(jīng)PCR驗證后，在BMMY培養(yǎng)基中甲醇誘導培養(yǎng)，在未添加血紅素的培養(yǎng)液中MnP胞外酶活在72 h達到最高為7 U/L，表明Lgmnp1已被轉化至畢赤酵母中并可誘導表達。[結論]該方法對偏腫革裥菌Lgmnp1基因的克隆及表達情況進行研究，為偏腫革裥菌Lgmnp1基因的進一步應用提供了依據(jù)。

關鍵詞 偏腫革裥菌；錳過氧化物酶；基因克?。划叧嘟湍?；基因表達

中圖分類號 S718.81 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）11-03186-05

Abstract [Objective] To study cloning and expression of Lgmnp1 gene from Lenzites gibbosa. [Method] A full length DNA gene Lgmnp1 encoding for an isoenzyme of manganese peroxidase （MnP） from Lenzites gibbosa stain CB1 （GenBank accession No. JQ327834） was cloned by the methods of PCR， RACE， and Genome Walking PCR with primers designed based on the conserved sequences of the known MnP genes from other whiterot fungi and amplified DNA fragments. [Result] Protein sequence analysis showed that LgMnP1 belonged to short MnP due to its 4 disulfide bonds. The predicted molecular mass of mature LgMnP1 was 35.94 kDa， and the pI was 4.43. The full open reading frame（ORF） sequence of Lgmnp1 was cloned by restriction enzyme digestion primers. The recombinant plasmid pPICZB/Lgmnp1 was constructed by ligating the ORF sequence and the expression plasmid pPICZB both digested by the restriction enzyme EcoRI and XbaI. Then the pPICZB/Lgmnp1 was transformed into P. pastoris by electroporation. After verified by PCR， two transformant Pichia strains were cultured in BMMY medium and induced by anhydrous methanol added at each 24 h， and their MnP activities were determined during 96 h. Results showed that the transformant strain 1 could produce MnP activity in the absence of heme， and the highest MnP activity in the culture supernatant was 7 U/L after 72 h incubation， indicating that the gene Lgmnp1 had been effectively transformed into the recombinant Pichia pastoris SMD1168HLgmnp1 and expressed in inductive environment. [Conclusion] The cloning and expression of Lgmnp1 gene from Lenzites gibbosa was studied， which will provide a reference for further application of Lgmnp1 gene.

Key words Lenzites gibbosa； Manganese peroxidase（MnP）； Gene cloning； Pichia pastoris； Gene expression

木質素是苯丙烷類結構單元之間以醚鍵和碳碳鍵相連接的一類復雜的天然芳香族高聚物，與其他生物高分子如纖維素等明顯不同，不含易水解的重復單元，因而不受水解酶的控制，其生物降解機制是氧化作用；其分子結構復雜且含有較多的在生物學上穩(wěn)定的鍵型，性狀穩(wěn)定，難以為一般的微生物所分解。能夠引起木質素強烈分解的只有木材白腐菌（White rot fungi），而木材褐腐菌、細菌及放線菌一般只能部分地改變木質素分子的結構，或將已被白腐菌降解到一定程度的木質素及其斷裂的芳香化合物進一步加以分解。由于白腐菌能夠有效地降解木質素，及廢水和土壤中難被降解的多氯聯(lián)苯、多環(huán)芳烴、DDT、染料、炸藥及疊氮化合物等有毒物質。因此，研究白腐菌的酶學及其基因學具有重要的應用意義。白腐菌產(chǎn)生的木質素降解酶主要包括錳過氧化物酶（Manganese Peroxidase，MnP）、木質素過氧化物酶（Lignin Peroxidase，LiP）和漆酶（laccase）等。一些白腐菌產(chǎn)生上述這3種分解木質素的酶，而大多數(shù)白腐菌僅產(chǎn)生2種甚至1種分解木質素的酶，表明這3種酶在分解木質素的過程中并不是全都必需的。MnPs（EC 1.11.1.13）是一種依賴H2O2的含F(xiàn)e3+和血紅素輔基的糖基化細胞外過氧化物酶，廣泛存在于白腐菌中，到目前為止在其他微生物中并未發(fā)現(xiàn)有MnP的相關報道。MnP可氧化木質素中的酚類和非酚類的結構單元。

基因克隆與表達是目前國內(nèi)外對于基因研究的一個主要技術手段[1]。國外目前已經(jīng)被克隆的MnP同工酶基因主要有：黃包原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）的mnp1、mnp2、mnp3和mnp4[2]，蟲擬蠟菌（Ceriporiopsis subvermispora）的mnp1、mnp2A、mnp2B、mnp3和mnp4[3]，云芝（Trametes versicolor）的mnp1和mnp2[4]，射脈菌（Phlebia radiata）的mnp1、mnp2和mnp3[5]，香菇（Lentinula edodes）的mnp1[6]，地中海擬層孔菌（Fomitiporia mediterranea）的mnp1、mnp2和mnp3[7]等。但國內(nèi)對MnP同工酶基因的研究還較少。偏腫革裥菌（Lenzites gibbosa）是一種對木材和木質素分解能力較強的白腐菌，對該種MnP基因的研究國內(nèi)外尚屬空白。筆者在完成該菌株一個編碼MnP蛋白基因Lgmnp1克隆的基礎上，將該mnp基因轉化到了畢赤酵母中實現(xiàn)了異源表達，以期為以后該類基因的功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris SMD1168H及酵母表達載體質粒pPICZB，購自Invitrogen公司；偏腫革裥菌L.gibbosa菌株CB1，自長白山采集并分離，菌種保藏于東北林業(yè)大學森林病蟲病理實驗室。YPD平板培養(yǎng)基：1%（W/V）酵母粉；2%（W/V）蛋白胨；2%（W/V）葡萄糖；2%（W/V）瓊脂粉；100 μg/ml Zeocin。產(chǎn)酶基礎培養(yǎng)基為低氮天冬酰胺-琥珀酸培養(yǎng)基（LNAS，Low Nitrogen Asparagine Succinic acid）[8]。BMGY/BMMY培養(yǎng)基：1%（W/V）酵母粉；2%（W/V）蛋白陳：100 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.0）；1.34% YNB；4×10-5%生物素；1%甘油/1%甲醇。

1.2 Lgmnp1 基因克隆

1.2.1 Lgmnp1 基因DNA片段的擴增。離心收集生長在2.000 g青楊（Populus ussuriensis）木屑為產(chǎn)酶底物的LNAS培養(yǎng)液內(nèi)9～13 d的菌絲[9]，液氮凍存?zhèn)溆?。使用TIANGEN公司的DNAquick快捷型植物基因組DNA試劑盒提取所收集菌絲的基因組DNA。 根據(jù)白腐菌MnP基因序列保守區(qū)設計引物1F、1R（表1），以L.gibbosa基因組DNA為模板，擴增Lgmnp基因的DNA片段。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。具有目的條帶的PCR擴增產(chǎn)物測序后進行BLAST比對，確認與MnP同源后，根據(jù)該序列外顯子部分設計RACE引物。

1.2.2 Lgmnp1全長DNA基因的擴增。用OMEGA公司的E.Z.N.A.TM總RNA提取試劑盒及相關方法提取總RNA。根據(jù)“1.2.1”中獲得的DNA序列外顯子部分設計了一條5′RACE引物（表1），使用Clontech 的SMART RACE cDNA擴增試劑盒進行5′RACE反應，反應體系及條件詳見試劑盒說明書。根據(jù)5′ RACE獲得的cDNA片段，設計一對特異性基因組上下游引物DNAup和DNAdown，以L.gibbosa基因組DNA為模板，擴增該引物對范圍內(nèi)的DNA序列。根據(jù)該DNA序列設計5′和3′端walking PCR 引物，其5′上游序列的擴增見[10]，兩輪3′端引物見表1，用TaKaRa公司的染色體步移試劑盒（Genome Walking Kit）及相關方法進行基因組序列擴增。引物設計要求、PCR的反應體系、擴增的溫度條件和循環(huán)數(shù)等見（http：//www.takara.com.cn/？action=Page&Plat=pdetail&newsid=289&subclass=1）。擴增完畢后，取第2、3輪PCR反應液各2 μl，用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，觀察電泳圖確定目的條帶。對獲得的序列進行比對、拼接，獲得全長DNA基因。通過NCBI的ORF Finder （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov /projects/gorf/）查找該基因的讀碼框ORF，分析起始密碼子，終止密碼子，以及5′ 非翻譯區(qū)和3′ 非翻譯區(qū)等信息。使用BioEdit分析軟件對 cDNA核苷酸序列進行堿基成分分析，將cDNA核苷酸序列翻譯為氨基酸序列，并對其氨基酸組成進行分析。使用NCBI的BLAST和Conserved Domain Database（CDD）軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析蛋白序列的基本信息、保守結構域。采用Signal Scan（http：//wwwbimas.cit.nih.gov/molbio/signal/）和SignalP 4.0（ http：//www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/）預測蛋白信號肽。

1.3 Lgmnp1在畢赤酵母中的表達

1.3.1 重組質粒的構建與驗證。以“1.2.2”中5′RACE中RTPCR獲得的cDNA第一鏈為模板，用上游引物BDF：5′CGGAATTCATGGCGTTCAAGCTACTC 3′，下劃線為EcoRI酶切位點；和下游引物BDR：5′GCTCTAGATTAGGACGGGGGGACGGG 3′，下劃線為XbaI酶切位點，PCR擴增Lgmnp1完整編碼序列（coding sequence，CDS）。將Lgmnp1完整CDS與表達載體質粒pPICZB分別用EcoRI和XbaI雙酶切，然后用T4連接酶進行連接，構建重組質粒pPICZB/Lgmnp1。將連接產(chǎn)物轉化到大腸桿菌Top10中，藍白斑篩選陽性克隆，用質粒提取試劑盒提取質粒，用雙酶切引物BDF和BDF進行PCR驗證，及用EcoRI和XbaI進行雙酶切驗證。對驗證正確的重組質粒用AOX通用引物進行測序和堿基突變分析。

1.3.2 重組質粒轉化畢赤酵母及轉化子的MnP活性檢測。對含重組質粒的Top10陽性克隆提取質粒DNA，通過BamH I單酶切將其線性化，電轉化到巴斯德畢赤酵母P.pastoris 的感受態(tài)細胞中。用含有Zeocin的YAD平板進行篩選，獲得的轉化子用AOX通用引物及引物BDF和BDR進行PCR驗證。將PCR驗證正確的轉化子菌株接種到BMGY培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)（30 ℃，280 r/min）至OD600在2～6，離心收集菌體，重懸于BMMY培養(yǎng)基中至OD600=1，每24 h加入無水甲醇至終濃度0.5%。由于血紅素是MnP在酵母中表達的限制性因素，因此設置2組試驗，分別為不添加和添加血紅素，添加血紅素的終濃度為500 mg/L[10]。在0～96 h內(nèi)每隔12 h提取菌液進行酵母生長量（以OD600作為酵母的相對生長量）和MnP活性檢測，酶活檢測方法同[8]。

2 結果與分析

2.1 Lgmnp1全長基因的克隆結果 首先，以L.gibbosa DNA為模板，用引物1F和1R擴增到一個400 bp目的基因片段。將該序列進行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)其與T.versicolor的MnP序列具有較高同源性，為83%，因此確定該序列為L.gibbosa的MnP基因片段。其次，通過5′ RACE PCR擴增得到約500 bp目的條帶，測序結果顯示該序列中包含5′ RACE接頭引物和特異性引物5′ race GSP。BLAST比對結果表明，該5′ RACE片段與T.versicolor的MnP序列同源性可達82%。但該序列與最初獲得的MnP基因400 bp片段序列差異較大，無法拼接。這一結果是由于白腐真菌中存在MnP基因家族，且不同的MnP基因之間存在較高的相似性。于是，試驗將該5′ RACE片段命名為Lgmnp1。根據(jù)基因組特異性上下游引物DNAup和DNAdown獲得415 bp DNA片段，序列比對表明該片段與5′ RACE獲得的基因片段具有重疊區(qū)域，為Lgmnp1的DNA序列。5′上游walking PCR的結果見[10]。為了獲得該Lgmnp1基因的3′端序列，試驗繼續(xù)利用walking PCR方法。第1輪PCR擴增獲得3′端1 014 bp的序列，該序列與415 bp DNA片段有334 bp重疊區(qū)域，第2輪3′端PCR擴增得到2 292 bp目的DNA序列，該序列與walking PCR第1輪序列有318 bp的重疊區(qū)域，這一結果表明所得序列即為Lgmnp1下游3′端序列。通過序列拼接得到完整的Lgmnp1 DNA序列，GenBank登錄號為JQ327834。并比對出完整的cDNA基因，登錄號分別為FJ848739。

序列結構分析的結果表明，基因Lgmnp1的DNA全長4 595 bp，含有6個外顯子和5個內(nèi)含子，外顯子長13～340 bp，內(nèi)含子長56～68 bp；其cDNA基因含有49 bp的5′UTR及129 bp的3′UTR序列，編碼區(qū)長度為1 095 bp。從ATG到TAA的cDNA序列GC含量占65%，而DNA序列由于加入了內(nèi)含子導致了GC含量下降了3.2%。在cDNA水平上Lgmnp1與T.versicolor的mnp、mnp2、cmp5和cmp3基因（GenBank登錄號分別為AJ745879、AF102515、AY677131、AY677130）覆蓋率為100%，其相似性最高為82%～83%。

2.2 推定的偏腫革裥菌錳過氧化物酶1（LgMnP1）的特征 LgMnp1基因編碼364個氨基酸（amino acid，aa）的蛋白質多肽前體（GenBank登錄號：ACO92620），包含了一個21aa的信號肽及5aa的前導短肽。LgMnP1成熟蛋白長度為338 aa，預測成熟蛋白分子量為35.94 kD，pI為4.43，帶負電荷殘基（Asp+Glu）有43個，帶正電荷殘基（Arg+Lys+His）有30個，總原子數(shù)為4 979個，分子式為C1588H2447N433O501S10。其催化結構、晶體結構和功能有關的氨基酸殘基與其他白腐菌的MnP類似，都具有保守性。主要包括：①3個與血紅素連接的氨基酸R43、H47和H176。②3個與Mn2+連接的氨基酸E36、E40和D182。③5個與血紅素近側末端的Ca2+連接的氨基酸 T177、D194、T196、E198和D201，4個與遠側末端的Ca2+連接的氨基酸D48、G66、D68和S70。④構成4個二硫橋的8個半胱氨酸殘基C3∶C15、C14∶C285、C34∶C120和C249∶C314。氨基酸序列比對結果表明，Lgmnp1與T.versicolor的MnP（CAG33918）同源性最高為88%，與Polyporus brumalis的MnP3蛋白（AEJ37996）同源性為86%。Lgmnp1由于含有4個二硫鍵，可將其歸入短MnPs類群。

2.3 Lgmnp1基因的完整CDS擴增 PCR擴增獲得約1.1 kb的特異性目的條帶，見圖1A。凝膠回收該片段，加A尾處理后與T克隆載體連接，轉化大腸桿菌后，篩選出5個陽性轉化子，分別提取質粒進行PCR驗證，結果有3個轉化子PCR驗證正確，見圖1B中的3、5、7泳道。將這3個單克隆的培養(yǎng)菌液進行測序，與Lgmnp1的ORF序列進行比對，結果序列比對結果完全一致，未發(fā)生堿基突變。

2.4 重組質粒pPICZB/Lgmnp1的驗證 通過引物BDF和BDR對重組質粒pPICZB/Lg mnp1進行PCR驗證，結果顯示在1.1 kb處產(chǎn)生清晰特異性條帶，與CDS序列大小一致，見圖1C；用EcoRI和XbaI雙酶切后在1.1和3.3 kb處產(chǎn)生2條清晰特異性條帶，1.1 kb處為目的CDS條帶，3.3 kb處為pPICZB載體條帶，見圖1D。對重組質粒用AOX通用引物測序，結果發(fā)現(xiàn)該序列未有堿基發(fā)生突變。以上結果說明Lgmnp1的完整CDS序列已經(jīng)連入pPICZB載體中，重組質粒pPICZB/Lgmnp1構建成功。

2.5 畢赤酵母轉化子的PCR驗證 將轉化后在篩選平板上生長的酵母菌株分別命名為1、2和3號菌株，用AOX通用引物和引物BDF和BDR進行PCR驗證，結果如圖1E。其中2～4泳道為引物BDF和BDR的PCR擴增結果，5～7泳道為AOX通用引物PCR擴增結果。引物BDF和BDR的PCR擴增結果中僅第2泳道的1號菌株在1.1 kb處有一條較為模糊的目的條帶；AOX通用引物PCR擴增的第5、7泳道的1和3號菌株各自顯示2條帶，其中1.3 kb條帶為目的基因與約200 bp的pPICZB載體序列，2.1 kb條帶為AOX1基因條帶。該結果表明pPICZB/Lgmnp1重組質粒已被整合到畢赤酵母菌株中。因此，繼續(xù)用1和3號菌株進行MnP的誘導表達。

2.6 畢赤酵母轉化子生長量的測定和重組MnP的誘導表達 畢赤酵母在MM培養(yǎng)基中的生長量通過測定600 nm處的吸光度值OD600來確定。如圖2A所示，重組酵母菌株的生物量隨著時間的增長不斷增加，菌株1和3的生長速度幾乎相同，但添加血紅素處理菌株明顯比未處理菌株生長要慢，如圖2B所示。3號菌株在培養(yǎng)過程中無論是否添加血紅素都未檢測到MnP酶活；而菌株1在未加入血紅素的培養(yǎng)基中，在48 h出現(xiàn)MnP的酶活性，72 h達到最大酶活力為7 U/L，96 h幾乎下降為0，說明Lgmnp1已經(jīng)有效地被轉化到了畢赤酵母菌株中，并在甲醇誘導下得到表達。但該菌株在添加了血紅素的培養(yǎng)基中反而未檢測到MnP的活性變化。

3 結論與討論

為了有效地探討白腐菌錳過氧化物酶MnP基因的表達調控機理，有必要進行該基因的轉化與表達研究。編碼白腐菌木質素降解酶系統(tǒng)的基因已經(jīng)在幾種宿主細胞中得到表達，主要有大腸桿菌（Escherichia coli）、巴斯德畢赤酵母（P.pastoris）[9]及構巢曲霉（Aspergillus nidulans）等絲狀真菌。目前已商業(yè)化的基因工程產(chǎn)品大多是通過（E.coli）表達的，其主要優(yōu)點是成本低、產(chǎn)量高、易于操作。但由于其是原核生物，不具有真核生物的基因表達調控機制和蛋白質的加工修飾能力，其產(chǎn)物往住形成沒有活性的包涵體，需要經(jīng)過變性、復性等處理才能應用。如MnP基因在E.coli中的表達產(chǎn)物既為無血紅素插入的、無酶活性的包涵體。近年來以酵母作為工程菌表達外源蛋白日益受到重視和利用，原因是酵母是一種單細胞真核生物，其不僅具有易培養(yǎng)、繁殖快、遺傳操作簡單等優(yōu)勢，還具有真核生物表達時對蛋白質進行正確加工、修飾、合理的空間折疊等功能，有利于真核基因的表達。P.pastoris是甲基營養(yǎng)型酵母，是經(jīng)過改進的第2代整合型表達系統(tǒng)，其表達載體包含乙醇氧化酶1（AOX1）基因的啟動子和轉錄終止子（5′AOX1和3′AOX1），它們被多克隆位點（MCS）分開，外源基因可以在此插入。當整合型載體轉化受體酵母時，其5′AOX1和3′AOX1能與染色體上的同源基因重組，從而使整個載體連同外源基因插入到酵母染色體上，形成穩(wěn)定遺傳的細胞系，外源基因在5′AOX1啟動子控制下表達。P.pastoris基因表達系統(tǒng)經(jīng)過近十年發(fā)展，已基本成為較完善的外源基因表達系統(tǒng)。試驗首先采用PCR、RACE及染色體步移等方法，克隆了偏腫革裥菌L.gibbosa菌株CB1的MnP1全長基因Lgmnp1和完整CDS基因，在對該基因與蛋白序列進行了基本生物信息學分析的基礎上，將其CDS基因整合到重組質粒pPICZB/Lgmnp1并轉化到了P.pastoris的基因組中，使該基因在甲醇誘導下實現(xiàn)了異源表達。

由于白腐菌分泌的MnPs在自然狀態(tài)下是高度螺旋的含血紅素的五聚物糖蛋白，所以MnPs蛋白翻譯后血紅素的加入是修飾的必有環(huán)節(jié)。關于MnP在P.pastoris中異源表達的報道，例如黃孢原毛平革菌（P.chrysosporium）的mnp2基因在P.pastoris中得到成功表達，提及到血紅素對其活性的影響很大[9]，P.chrysosporium的MnP1基因也已經(jīng)在A.oryzae中實現(xiàn)了表達，但血紅素仍為MnP酶活的限制性因素[11]。在這些文獻中提及了血紅素的終濃度為500 mg/L，配制方法使用0.1～1.0 mol/L的NaOH溶液，因此試驗也嘗試用血紅素來提高重組MnP的表達活性，選擇了用0.1 mol/L NaOH配置血紅素溶液，所用濃度為500 mg/L，但卻未能夠檢測到MnP的活性。分析原因一種可能是由于血紅素只溶于弱堿性環(huán)境，添加堿性的血紅素溶液后酵母生長環(huán)境的pH值發(fā)生了變化，改變了酵母的最適生長環(huán)境，這對酵母的生長具有一定的抑制作用，而這可能也阻礙了酵母轉化子對MnP的分泌和表達。添加血紅素后生物量的確下降了，這點從圖2A中可觀察到。第2種可能是由于血紅素的濃度過高，500 mg/L不是適宜的濃度，今后還需要通過梯度篩選對血紅素的用量進一步摸索，同時對添加方式、時間等條件進一步測試。

試驗獲得重組MnP的酶活較低，雖然酵母轉化子比本體菌株表現(xiàn)出MnP的活性時間提前了2～3 d，這一結果與相關報道類似[9]。因此無法進行蛋白純化及相關的酶學分析等后續(xù)試驗。重組酵母MnP的表達活性低還可能與重組酶信號肽的選擇有關，畢赤酵母胞外表達外源蛋白時信號肽的選擇是影響外源蛋白表達量的一個重要因素，信號肽在引導蛋白分泌到胞外的過程中發(fā)揮著重要作用，不同的信號肽可導致目的蛋白分泌量的不同，可進一步嘗試選用釀酒酵母的a因子前導肽（aMF）作為MnP基因在畢赤酵母中實現(xiàn)表達的信號肽。外源基因在酵母中的表達活性低還與酵母的培養(yǎng)條件及酵母培養(yǎng)過程中外源表達蛋白產(chǎn)生的誘導條件有關，還需對重組酵母的培養(yǎng)條件和產(chǎn)生MnP的誘導條件進行優(yōu)化。

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