吳轉娣等

摘 要 將雙價抗蟲基因，即修飾的蘇云金芽孢桿菌毒蛋白基因（Cry1Ac）和修飾的豇豆胰蛋白酶抑制劑基因（sck）導入甘蔗優(yōu)良品種ROC22，獲得潮霉素抗性轉化植株95株，35株能檢測到外源抗蟲基因，獲得的13株RT-PCR雙基因均呈陽性的甘蔗植株，斑點雜交檢測有4株呈陽性。結果表明：外源抗蟲基因已導入甘蔗基因組中。

關鍵詞 甘蔗；根癌農(nóng)桿菌介導法；Cry1Ac；sck；遺傳轉化

中圖分類號 S688 文獻標識碼 A

Abstract In the paper sugarcane， the cultivar ROC22 was genetically transformed with both Cry1Ac gene and sck gene， and selected with hygromycin B via agrobacterium-mediated transformation system. 95 transformed plantlets were obtained， and 35 of them showed positive by polymerase chain reaction. Furthermore， thirteen PCR-positive plantlets were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction， all were positive. Thirteen of the RT-PCR-positive plants were taken for dot blot analysis， four of which were positive. The result showed that foreign genes were integrated into the sugarcane genome.

Key words Sugarcane； Agrobacterium-mediated； Cry1Ac； sck； Genetic transformation

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.023

甘蔗抗蟲基因工程育種一直是甘蔗產(chǎn)業(yè)的重要發(fā)展方向，每年中國甘蔗產(chǎn)業(yè)因螟蟲危害導致的損失高達數(shù)十億，甚至上百億元，另外每年數(shù)十萬噸劇毒農(nóng)藥投入蔗田，殺蟲效果并不理想，反而加重了害蟲的抗性，并導致嚴重的環(huán)境污染和人畜中毒事故[1]。近年來，隨著中國經(jīng)濟的發(fā)展，農(nóng)村人口大量進入城市，甘蔗產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)方式也發(fā)生了改變，為確保甘蔗產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和食糖安全，迫切需要利用基因工程技術培育和發(fā)展抗蟲轉基因甘蔗新品種。利用基因工程技術將殺蟲蛋白基因導入植物中提高植物的抗蟲性，已成為當今植物基因工程的研究熱點之一。目前轉基因甘蔗的技術已成熟，已有許多獲得轉基因植株的報道[2-8]。

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等多種昆蟲具有髙度特異性，是目前應用最廣泛的抗蟲基因[9]。1997年，Arencibia等[10-11]首次將經(jīng)過修飾的Cry1A（b）基因導入甘蔗并獲得了表達。2006年Weng等[12]為提高m-Cry1Ac的表達，對基因進行了密碼子的改造，并將其GC含量提高到47.5%，在Ubi啟動子驅動下導入甘蔗YT79-177和ROC16，經(jīng)免疫分析確定，有18個轉基因株系表達，飼喂于甘蔗蛀莖蟲，1周內全部死亡，而對照品種的葉莖則遭受嚴重蟲害。之后Weng[13]再次將GC含量提高到54.8%，再一次提高了Cry1Ac基因的表達量，達到了2.2～50 ng/mg。馮翠蓮等[14-15]構建了Cry1Ab和Cry1A（c）基因的植物表達載體，通過農(nóng)桿菌介導法轉化甘蔗，均獲得了陽性植株。

豇豆胰蛋白酶抑制劑（Cowpea Trypsin Inhibitor，CpTI）來自豇豆的可食用部分，其抗蟲譜廣、對人畜無副作用及昆蟲不易產(chǎn)生耐受性，是繼Bt基因之后應用較廣的抗蟲基因。CpTI基因已被轉到煙草、水稻、棉花等許多作物中。1997年澳大利亞Nutt等[16]、2001年Braga等[17]分別將馬鈴薯蛋白酶抑制劑基因和Bt基因轉入甘蔗，獲得了對蠐螬及螟蟲具有抗性的植株。2003年，F(xiàn)alco[18]將大豆孔尼茲胰島素抑制劑（SKTI）和包曼-布瑞克抑制劑（SBBI）基因導入甘蔗基因組并得到表達，獲得了在一定程度上抵抗甘蔗鉆心蟲的轉基因植株，但田間抗性不甚理想，鉆心蟲仍能對其產(chǎn)生危害。而修飾的cpti基因被導入水稻、棉花植株獲得了很好的抗蟲性[19，20]，實驗證明轉修飾cpti基因的植物無論是抗蟲蛋白含量還是抗蟲能力均比轉野生型cpti基因植物有顯著的提高[21]。Christy等[22]2009年將抑制甘蔗螟蟲生長的抑肽酶合成基因導入甘蔗中，經(jīng)測定轉基因甘蔗的抑肽酶水平發(fā)生變化，在生測試驗中，喂食了轉基因甘蔗的螟蟲幼蟲重量顯著降低，其生長發(fā)育受到嚴重影響。2010年，Arvinth等[23]將經(jīng)過密碼子改造的Cry1Ab基因單個導入已轉胰蛋白酶抑制劑基因的甘蔗中，在雙基因的轉基因甘蔗中其枯心率比轉Cry1Ab單基因植株更低，表明Cry1Ab基因與抑制劑基因在轉基因甘蔗中存在協(xié)同效應。

本研究以甘蔗品種ROC22為轉化受體，潮霉素為篩選標記，通過農(nóng)桿菌介導法將雙價抗蟲基因，即修飾的蘇云金芽孢桿菌毒蛋白基因（Cry1Ac）和修飾的豇豆蛋白酶抑制基因（sck）導入甘蔗，獲得高效廣譜的抗蟲甘蔗新品系。

1 材料與方法

1.1 材料

甘蔗材料為新臺糖22（ROC22），采自云南省農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所所內基地。植物表達載體pCDMARUBAC-Hpt由云南農(nóng)業(yè)大學曾千春研究員提供，農(nóng)桿菌菌株EHA105為本實驗室保存。

pCDMARUBAC-Hpt含潮霉素磷酸轉移酶基因（Hpt）、修飾的豇豆胰蛋白酶抑制基因（sck）及修飾的蘇云金芽孢桿菌毒蛋白基因（Cry1Ac），篩選標記和抗蟲基因分別置于2個獨立的T-DNA區(qū)（圖1）。

Taq DNA聚合酶、限制性核酸內切酶、凝膠回收試劑盒、Marker均購自TaKaRa公司；卡那霉素（Kan）、鏈霉素（Str）、羥芐青霉素（Car）、利福平（Rif）等購自Sigma公司，PCR引物合成和測序由上海生物工程服務有限公司完成。RNA提取試劑盒購自OMEGA公司，反轉錄試劑盒購自Promega公司，地高辛標記與檢測試劑盒購自Roche公司，其他常用的分子生物學試劑主要購自上海生物工程服務有限公司。

1.2 方法

1.2.1 農(nóng)桿菌的轉化 利用常規(guī)的CaCl2法制備農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞，再以“凍融法”將植物表達載體pCDMARUBAC-Hpt導入農(nóng)桿菌EHA105中[24]。

1.2.2 甘蔗的遺傳轉化 （1）甘蔗胚性愈傷組織的誘導。選擇處于拔節(jié)期生長健壯的甘蔗植株，取頂端莖段，于超凈工作臺中剝取甘蔗的幼嫩葉片作為外植體，將其切成1 mm的薄片，接種于愈傷誘導培養(yǎng)中，（25±1）℃暗培養(yǎng)約6～8周，每2周轉接至新的愈傷繼代培養(yǎng)基中，獲得胚性愈傷組織。

（2）農(nóng)桿菌的活化。將含有pCDMARUBAC-Hpt的EHA105菌種涂板于三抗（含有Kan 50 μg/mL，Str 50 μg/mL，Rif 50 μg/mL）YEP固體培養(yǎng)基中（28±1）℃暗培養(yǎng)3 d，挑取單菌落于液體三抗YEP培養(yǎng)約18 h。

離心收集菌體并用液體轉化培養(yǎng)基重懸，添加150 μmol/L的AS（乙酰丁香酮），（22±1）℃，100 r/min搖動培養(yǎng)2 h，獲得工程菌液。

（3）胚性愈傷組織的預處理。轉化前將胚性愈傷組織轉接至新鮮繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d，置于無菌的濾紙上再吹1～2 h，至組織塊表面干燥，稍有收縮，即可用于浸染試驗。

（4）轉化。將組織塊置于農(nóng)桿菌工作菌液中浸泡約30～40 min，期間10 min搖動1次。濾去菌液轉移至濾紙上晾干，表面干爽、無水膜時，切成0.3～0.5 cm的小塊。轉接至含100 μmol/L的AS固體轉化培養(yǎng)基上，（ 22±1）℃黑暗培養(yǎng)3～4 d。

（5）分化與篩選。將胚性愈傷組織轉移到含有Car 200 mg/L，潮霉素10.0 mg/L的分化培養(yǎng)基上，28 ℃弱光照（500～800 lx）下培養(yǎng)3周。轉接至叢芽誘導培養(yǎng)基中，依次添加濃度梯度為20.0、30.0、40.0 mg/L的潮霉素，對分化幼苗進行篩選，并培養(yǎng)出叢生芽。再轉接到生根培養(yǎng)基中誘導生根，獲得轉化植株。

1.2.3 轉化甘蔗植株DNA的提取及PCR檢測

甘蔗轉化植株的基因組DNA經(jīng)CTAB法小量提取獲得[26]，測定OD230、OD260和OD280的值，記錄OD260/OD230、OD260/OD280和DNA濃度值。根據(jù)不同濃度將DNA稀釋成50～100 ng/μL。同時經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。

以總DNA為模板，Cry1Ac、sck基因引物（見表2）擴增目的片段，循環(huán)參數(shù)為：94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30 s。以pCDMARUBAC-Hpt質粒DNA作正對照，以未轉化甘蔗的DNA為負對照，PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析并照相。PCR產(chǎn)物回收連接PMD-18T載體，導入大腸桿菌送華大公司測序。

1.2.4 RT-PCR檢測 取PCR檢測Cry1Ac、sck基因均呈陽性的甘蔗植株為材料，非轉化植株葉片作為對照，提取甘蔗總RNA。反轉錄合成cDNA第一鏈。

以反轉錄合成的cDNA為模板，Cry1Ac、sck基因引物擴增目的片段，循環(huán)參數(shù)為：94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30個循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。

1.2.5 斑點雜交檢測 取RT-PCR呈陽性的甘蔗轉化植株總DNA 50 μg，回收Cry1Ac基因擴增產(chǎn)物，連接PMD-18T載體并測序鑒定，酶切產(chǎn)物進行地高辛標記，于尼龍膜上進行斑點雜交，斑點雜交方法參照Roche 公司DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ試劑盒說明書，質粒pCDMARUBAC-Hpt作為正對照，非轉化植株作為負對照。

2 結果與分析

2.1 PCR檢測農(nóng)桿菌的轉化

將植物表達載體pCDMARUBAC-Hpt轉入農(nóng)桿菌EHA105，通過單菌落培養(yǎng)和PCR檢測證明其已成功導入農(nóng)桿菌中（圖2）。

2.2 甘蔗胚性愈傷組織的誘導和抗性篩選

甘蔗的幼嫩葉片于愈傷誘導培養(yǎng)中培養(yǎng)6～8周，繼代培養(yǎng)2次，獲得黃白色、表面高低不平呈顆粒狀突起、質地較松脆的顆粒狀愈傷組織（圖3），此類愈傷組織即為胚性愈傷組織，適合用于轉化。

采用梯度濃度對轉化植株進行篩選，依次添加濃度梯度為10.0、20.0、30.0、40.0 mg/L的潮霉素，獲得抗性植株（圖3）通過生根培養(yǎng)后煉苗移栽沙床。

2.3 甘蔗總DNA的提取

提取甘蔗抗性植株總DNA，所得DNA的A260/A280值處于1.785～1.918之間，A260/A230處于1.934～2.330之間，說明DNA質量較高，酚類物質、色素、鹽和小分子物質等雜質較少，電泳結果見圖4。

2.4 PCR檢測

提取95株甘蔗抗性植株總DNA，通過Cry1Ac、sck基因引物進行PCR擴增，有35株能擴增到與目的基因大小一致的條帶，其中2個基因均擴增出目的條帶的有13株，只擴增出Cry1Ac基因的有16株，只擴增出sck基因的有6株。PCR產(chǎn)物回收測序并通過DNA man比對，結果顯示與目的基因序列同源性均達100%，初步證明外源基因已整合到甘蔗的基因組中（PCR結果見圖5、6）。

2.5 RNA的小量提取和RT-PCR檢測

利用Omega RNA提取試劑盒對PCR陽性甘蔗植株及對照甘蔗植株進行RNA的小量提取，部分結果見圖7。

以反轉錄產(chǎn)物為模板，利用上述引物擴增Cry1Ac、sck基因片段，PCR擴增獲得了目的條帶（部分結果見圖8、9）。結果表明，13株PCR呈陽性的甘蔗中，Cry1Ac、sck基因均在轉錄水平上獲得表達。

2.6 斑點雜交

提取了13株PT-PCR陽性甘蔗植株的DNA進行斑點雜交，結果有4株呈陽性（圖10），表明Cry1Ac基因已整合到甘蔗基因組中。

3 討論與結論

以CpTI為代表的植物蛋白酶抑制劑基因抗蟲機理不同于Bt基因，它對鱗翅目、鞘翹目和直翅目的許多害蟲都有明顯的抑制作用，但其殺蟲強度不及Bt基因。為了進一步提高轉基因植物的抗蟲性和擴大其抗蟲譜，將2個及2個以上的抗蟲基因同時導入植物已成為抗蟲分子育種的重要策略。目前報道的使用2個或以上抗蟲基因同時轉化甘蔗的研究相對較少[27-28]。

植物表達載體pCDMARUBAC-Hpt含雙T-DNA（transfer DNA）雙抗蟲基因，其中篩選標記基因Hpt在一個T-DNA區(qū)，2個抗蟲基因在另一個T-DNA區(qū)。目標基因CpTI基因進行了5′添加信號肽、3′添加內質網(wǎng)定位信號（signal-cpti-KDEL，簡稱sck） 修飾。為了應對基因沉默，克服轉基因的位置效應，在目標基因表達盒的兩側分別融合玉米核基質結合序列（Matrix Attachment Region， 簡稱MAR），最終形成MAR-抗蟲基因表達盒-MAR結構。期望利用這2個抗蟲機理和抗蟲譜不同基因間的優(yōu)勢互補，獲得高效廣譜的抗蟲甘蔗新品系，有效延長轉基因甘蔗的抗蟲年限。

本研究通過農(nóng)桿菌介導甘蔗品種ROC22獲得潮霉素抗性植株95株。其中，35個能檢測到外源抗蟲基因，通過PCR和RT-PCR檢測有13株雙基因均呈陽性，對13株甘蔗植株進行斑點雜交，有4株呈陽性。同時也開展了轉基因甘蔗農(nóng)藝性狀、抗蟲性以及遺傳穩(wěn)定相關研究（另文發(fā)表）。

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