覃軍 陳奕龍 張丹雁 曹曼

摘要[目的]研究不同光照條件對(duì)南大青葉中靛玉紅含量的影響，為開展南大青葉規(guī)范化種植提供科學(xué)依據(jù)。[方法]設(shè)置全陰生、半陰生和陽生3個(gè)不同光照條件組別，于3月份定植后，觀察植株生長狀況，于5月至次年3月分別采收南大青葉，采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定南大青葉中靛玉紅的含量。[結(jié)果]南大青葉中靛玉紅含量隨種植時(shí)間不同波動(dòng)較大，每個(gè)設(shè)置組組內(nèi)不同月份的靛玉紅含量均有極顯著差異（P<0.01）；各設(shè)置組間僅11及12月份靛玉紅含量無顯著性差異（P>0.05），其余月份不同設(shè)置組間均有顯著差異（P<0.05）。[結(jié)論]3種光照條件均適宜南板藍(lán)的生長，但綜合考慮光照對(duì)南大青葉靛玉紅含量、植株生長和產(chǎn)量的影響，認(rèn)為全陰及半陰條件更適宜種植南大青葉。

關(guān)鍵詞南大青葉；不同光照條件；靛玉紅；HPLC

中圖分類號(hào)R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）01-00059-02

基金項(xiàng)目廣東省科技廳產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目（2010B090400529）。

作者簡介覃軍（1976-），男，廣東廣州人，副主任中藥師，從事中藥飲片質(zhì)量控制研究，Email：qinkum@163.com。*通訊作者，教授，碩士生導(dǎo)師，碩士，從事中藥品種及真?zhèn)舞b別研究和中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究，Email：danyan64@21cn.com。

收稿日期20131206南大青葉來源于爵床科植物馬藍(lán)[Baphicacanthus cusia （Nees） Bremek.]的干燥葉和幼嫩莖葉，苦咸大寒，具有清熱解毒和涼血定驚等功效，廣泛分布于我國西南、華南及華東地區(qū)，具有悠久的民間及臨床藥用歷史，為抗病毒常用中草藥[1]，目前尚未列入國家和地方藥品標(biāo)準(zhǔn)。馬藍(lán)的地下部分根莖及根作南板藍(lán)根入藥，已被2010年版《中國藥典》收載[2]。張丹雁等已初步完成南板藍(lán)根規(guī)范化種植研究[3-5]，而關(guān)于南大青葉的規(guī)范化種植研究鮮有報(bào)道。

靛玉紅作為南板藍(lán)的主要有效成分之一，已成為南板藍(lán)根及其葉藥材的真?zhèn)舞b別、含量測(cè)定及質(zhì)量評(píng)價(jià)的公認(rèn)指標(biāo)成分[1-2，6]。影響南大青葉中靛玉紅含量的因素較多，包括生態(tài)環(huán)境、采收時(shí)間、加工及貯存方法等。筆者以靛玉紅為指標(biāo)成分，探討不同光照條件對(duì)南大青葉中靛玉紅含量及生長狀況的影響，以期為南大青葉規(guī)范化種植研究及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象。南大青葉藥材，均采自廣東省梅州市平遠(yuǎn)縣南板藍(lán)GAP種植基地，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室張丹雁教授鑒定為南大青葉正品。

1.1.2 主要儀器。Waters 515型高效液相色譜儀，購自美國Waters公司；Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector，購自美國Waters公司。

1.1.3 主要試劑。靛玉紅，購自中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)110717-200204；甲醇（色譜純及分析純），購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；二氯甲烷（分析純），購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；水為重蒸蒸餾水，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2方法

1.2.1 試驗(yàn)用地的選擇。試驗(yàn)選在廣東省梅州市平遠(yuǎn)縣石正鎮(zhèn)、海拔500 m左右、通風(fēng)及排水良好的山地進(jìn)行。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)。分別設(shè)置全陰生、半陰生及陽生3個(gè)不同光照條件的試驗(yàn)地塊，每地塊面積為100 m2，重復(fù)3次設(shè)置。陽生組：選擇四周無樹陰遮擋的開陽山地，進(jìn)行露天種植，種植地每天受直射光照射約8 h。半陰生組：選擇四周有小山坡遮擋的空曠山地，于種植地的東西兩向人工種植雜樹林作遮陰，保持良好的通風(fēng)，每天受直射光照射約4 h。全陰生組：選擇茂密雜樹林下，全天僅受散射光照射，除在冬季中午有極短時(shí)間的微弱直射光照射外，其余時(shí)間幾乎無太陽直射光照射。

1.2.3 樣品采集方法。于2012年2月底將無性繁殖所獲得的南板藍(lán)苗定植于試驗(yàn)地，種植密度均為30 cm×35 cm，田間管理方法相同情況下，觀察并記錄南大青葉生長狀況，于當(dāng)年5月至次年3月間每月定期隨機(jī)采集各地塊南大青葉，經(jīng)干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 色譜條件。色譜柱為ZORBAX Extend-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為無水甲醇-水（75∶25，V/V）；流速為1.00 ml/min；檢測(cè)波長為290 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μl。

1.2.5 對(duì)照品溶液的制備。精密稱取2.23 mg經(jīng)五氧化二磷干燥至恒重的靛玉紅對(duì)照品，置100 ml量瓶中，加無水甲醇-二氯甲烷（80∶20，V/V）溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為22.3 μg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取上述儲(chǔ)備液1.0 ml于10 ml量瓶中定容至刻度，即得2.23 μg/ml的對(duì)照品溶液。

1.2.6 供試品溶液的制備。準(zhǔn)確稱取1.000 g經(jīng)五氧化二磷干燥至恒重的南大青葉粉末（過3號(hào)篩），置索氏提取器中，加二氯甲烷120 ml提取至無色，提取液至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，于40 ℃蒸干溶媒，殘?jiān)脽o水甲醇-二氯甲烷（80∶20，V/V）分次溶解轉(zhuǎn)移，并稀釋定容至100 ml量瓶中，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1.2.7 方法學(xué)考察。（1）系統(tǒng)適應(yīng)性考察。取適量供試品溶液和對(duì)照品溶液，在“1.2.4”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，考察系統(tǒng)適應(yīng)性。（2）線性關(guān)系的考察。分別精密吸取2、5、10、20 μl（22.3 μg/ml）對(duì)照品儲(chǔ)備液及2、5和10 μl（2.23 μg/ml）對(duì)照品溶液，依據(jù)“1.2.4”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以對(duì)照品進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。（3）精密度試驗(yàn)。取同一對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“1.2.4”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算含量。（4）穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一供試品液，按“1.2.4”項(xiàng)下的色譜條件，分別于0、1、4、8、12和24 h時(shí)各進(jìn)樣1次，計(jì)算其峰面積的RSD。（5）重復(fù)性試驗(yàn)。精密稱取同一批南大青葉粉末各6份，按“1.2.6”項(xiàng)下的方法進(jìn)行制備，按“1.2.4”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，計(jì)算其峰面積的RSD。（6）加樣回收率試驗(yàn)。精密稱取0.100 g的已知靛玉紅含量的南大青葉粉末6份，分別精密加入22.3 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液5.00 ml，按“1.2.6”項(xiàng)下的方法進(jìn)行制備，依次測(cè)定，計(jì)算平均加樣回收率和RSD。

1.2.8 樣品的含量測(cè)定。精密稱取樣品1.000 g，按“1.2.6”項(xiàng)下中方法制備供試品溶液，按“1.2.4”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，按線性回歸方程計(jì)算樣品的含量，每份南大青葉樣品平行檢測(cè)3次。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析。采用SPSS 18.0分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）”表示，組間及組內(nèi)比較均采用單因素方差分析。

2結(jié)果與分析

2.1方法學(xué)考察

（1）系統(tǒng)適應(yīng)性考察。圖1表明，供試品溶液和對(duì)照品溶液在相同的時(shí)間上有對(duì)應(yīng)的吸收峰，各峰間的分離度良好，表明系統(tǒng)適應(yīng)性良好。（2）線性關(guān)系的考察。經(jīng)計(jì)算得線性回歸方程為：Y=95 708X+13 903，R=0.999 7。試驗(yàn)結(jié)果表明，在4.46～446.00 ng/ml范圍內(nèi)，靛玉紅濃度與峰面積的線性關(guān)系良好。（3）精密度試驗(yàn)。計(jì)算得含量的RSD為1.4%，表明靛玉紅含量測(cè)定的進(jìn)樣精密度良好。（4）穩(wěn)定性試驗(yàn)。計(jì)算得峰面積的RSD為1.7%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。（5）重復(fù)性試驗(yàn)。計(jì)算得峰面積的RSD為1.4%，表明該方法的重復(fù)性良好。（6）加樣回收率試驗(yàn)。由表1可知，平均加樣回收率為101.8%，RSD為2.1%，表明該方法所得結(jié)果可性、可靠，能夠滿足測(cè)量需要。