李武等

摘 要 采用鐵皮石斛試管苗，以組培室常用光照強(qiáng)度條件光強(qiáng)范圍內(nèi)，葉片SPAD值與單苗莖粗、總根尖數(shù)及葉片蔗糖合成酶活性呈顯著的正相關(guān)。因此，生產(chǎn)鐵皮石斛優(yōu)質(zhì)種苗的適宜組培光照強(qiáng)度大小為75 μmol/（m2·s），葉片SPAD值可能是衡量鐵皮石斛幼苗素質(zhì)的一項(xiàng)關(guān)鍵指標(biāo)。

關(guān)鍵詞 鐵皮石斛；試管苗；根系性狀；蔗糖合成酶；超氧化物歧化酶

中圖分類號(hào) S567 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Effect of Light Intensity on Seedling Growth and

Physiological Characteristics of Dendrobium

officinale Kimura et Migo in vitro

LI Wu1，2， ZHENG Jingrong1，2， MO Zhaowen3， LI Zhijun1，2， JIANG Li2

QIU Daoshou1， CHAI Shike1， LIU Xiaojin1，2*

1 Crops Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou， Guangdong 510640， China

2 Guangdong Golden Crops Agriculture Science & Technology Company， Guangzhou， Guangdong 510640， China

3 College of Agriculture， South China Agriculture University， Guangzhou， Guangdong 510642， China

Abstact The suitable light intensity has a great significance for cultivating high quality Dendrobium officinale seedlings in vitro. In the study， we used test-tube seedlings as the experimental material， and set four higher light intensity， T0（25 μmol/（m2·s）， T1（50 μmol/（m2·s）， T2（75 μmol/（m2·s）， T3（100 μmol/（m2·s）. T0 as the control was traditional light intersity level in tissue culture lab. We studied the effect of other treatments with higher light intensity on seedling growth and physiological characteristics. The results showed that， compared with T0， T2 increased significantly stem diameter per plant and fresh weight per plant under the premise of no significant influence on both green leaf number per plant and seedling number per bottle， respectively， also significantly increased the average diameter， root volume per plant and tips per plant， and coordinated the development of plant root traits and upper morphological characters， also significantly increased the SPAD value and SS activities of leaves. Correlation analysis also showed that， in a certain range of light intensity from 25 to 100 μmol/（m2·s）， the correlation of stem diameter per plant， tips per plant， leaf SS activity， and leaf SPAD value was significantly positive， respectively. So the appropriate light intensity level for the production of high quality tissue culture seedling of D. officinale was 75 μmol/（m2·s）. Besides， leaf SPAD value could be a key indicator of the seedling quality in D. officinale.

Key words Dendrobium officinale； Test-tube seedlings； Root traits； Sucrose synthase（SS）； Superoxide dismutase（SOD）

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.020

鐵皮石斛（Dendrobium Officinale Kimura et Migo）是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥，其主效成分包括特有的多糖[1-3]、生物堿[4]、菲類化合物[4]，以及除色氨酸以外的所有人體必需氨基酸和微量元素[5]等，具有增強(qiáng)免疫力[6-9]、抗腫瘤[10-11]、降血糖[12-13]、抗氧化[11，14-17]等藥理作用，在治療胃腸道疾病、白內(nèi)障、關(guān)節(jié)炎、血栓閉塞性脈管炎及慢性咽炎等疾病有很好的臨床療效[18]。近年來(lái)，野生資源因人為的過(guò)度采挖及其生境的嚴(yán)重破壞已瀕臨滅絕，而鐵皮石斛因種子極小、無(wú)胚乳，在自然條件下需與真菌共生才能萌發(fā)，其實(shí)生苗很難滿足日益增長(zhǎng)的人工栽培用種需要。目前，利用組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖試管苗是解決鐵皮石斛種苗需求的有效途徑，相關(guān)領(lǐng)域研究成為焦點(diǎn)[19-25]。

光照強(qiáng)度是影響鐵皮石斛幼苗形態(tài)建成的重要因素。有研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛試管苗在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的光飽和點(diǎn)和最大電子傳遞速率（ETRmax）變化相對(duì)比較穩(wěn)定，范圍內(nèi)鐵皮石斛試管苗生理活性較高，生長(zhǎng)發(fā)育較快[32]。光強(qiáng)過(guò)大往往導(dǎo)致鐵皮石斛葉色濃綠，苗體矮壯且幼苗增殖率大[33]。然而，不同光照強(qiáng)度條件下鐵皮石斛植株上部農(nóng)藝性狀與下部根系性狀的協(xié)調(diào)性及其與葉片生理活性的相關(guān)性的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究以鐵皮石斛組培苗為試驗(yàn)材料，以組培室常用光強(qiáng)條件為對(duì)照，研究不同光強(qiáng)對(duì)鐵皮石斛幼苗生長(zhǎng)及生理特性的影響，旨在為鐵皮石斛優(yōu)質(zhì)種苗規(guī)?；a(chǎn)技術(shù)體系的建立提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

鐵皮石斛（Dendrobium Officinale Kimura et Migo）由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所南藥研究室提供，種質(zhì)編號(hào)為NY0091。實(shí)驗(yàn)材料為葉色均勻、葉片數(shù)2～3個(gè)、長(zhǎng)勢(shì)一致且高約1.5 cm、莖粗2 mm的鐵皮石斛組培幼苗（單腋芽由莖端培養(yǎng)第4代后得到）。

1.2 方法

1.2.1 處理 培養(yǎng)容器選用容積標(biāo)準(zhǔn)組培玻璃瓶（直徑7 cm，高10 cm）。培養(yǎng)基選用1/2MS+0.2 mg/L NAA+10%香蕉汁+0.1%活性炭，并添加25 g/L蔗糖和7 g/L瓊脂，pH值調(diào)節(jié)在6.0左右，培養(yǎng)箱（PGX-1000A-12H）相對(duì)濕度為（70±5）%，溫度為（25±1）℃，光照時(shí)間為12 h/d。每個(gè)玻璃瓶?jī)?nèi)分裝35 mL培養(yǎng)基，分別移植6棵鐵皮石斛組培幼苗。

試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)光照強(qiáng)度處理：CK 25 μmol/（m2·s），T1 50 μmol/（m2·s），T2 75 μmol/（m2·s），T3 100 μmol/（m2·s）。自2011年12月10日起，每個(gè)光照培養(yǎng)箱內(nèi)放置30瓶鐵皮石斛幼苗，試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.2 測(cè)定 鐵皮石斛幼苗培養(yǎng)60 d后測(cè)量其農(nóng)藝性狀、根系性狀和葉片生理活性。

（1）農(nóng)藝性狀。在每個(gè)光照培養(yǎng)箱內(nèi)隨機(jī)取20瓶種苗，測(cè)定并計(jì)算出其單苗莖粗（采用游標(biāo)卡尺）、單苗鮮重、單苗綠葉數(shù)、每瓶苗數(shù)，3次重復(fù)的平均值即為各處理對(duì)應(yīng)指標(biāo)數(shù)值。

（2）根系性狀。采用根分析系統(tǒng)（加拿大Regent RHIZO根系分析系統(tǒng)，與文獻(xiàn)[34]所用儀器同）掃描樣品平均根直徑、單苗總根體積、單苗總根尖數(shù)、單苗總根長(zhǎng)及單苗總根表面積。

（3）葉片生理活性。在每個(gè)光照培養(yǎng)箱內(nèi)隨機(jī)取10瓶幼苗，并分別使用502型SPAD儀測(cè)定完全展開(kāi)頂1葉SPAD值，最后計(jì)算其平均值。蔗糖合成酶（SS，下同）活性參照文獻(xiàn)[35]的方法。超氧化物歧化酶（SOD，下同）活性參照《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》[36]的方法測(cè)定?？偤?（鮮質(zhì)量-干質(zhì)量）/鮮質(zhì)量×100%。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 本研究采用Excel 2007整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，使用DPS軟件按LSD法檢測(cè)不同處理間差異顯著性及進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 光照強(qiáng)度對(duì)鐵皮石斛植株上部幼苗生長(zhǎng)的影響

相對(duì)于CK（對(duì)照），T1和T2處理均能顯著提高鐵皮石斛的單苗莖粗和單苗鮮重，對(duì)其單苗綠葉數(shù)和每瓶苗數(shù)無(wú)顯著影響（表1）。然而，相對(duì)于對(duì)照，T3處理雖顯著提高了鐵皮石斛的單苗莖粗和單苗鮮重，卻降低鐵皮石斛的單苗綠葉數(shù)和每瓶苗數(shù)，其中每瓶苗數(shù)降幅高達(dá)25.92%。因此，相對(duì)于常規(guī)光強(qiáng)條件，較大的光照強(qiáng)度有利于提高鐵皮石斛植株上部幼苗質(zhì)量，結(jié)合植株側(cè)芽發(fā)生數(shù)量考慮，光照強(qiáng)度適宜值范圍為50～75 μmol/（m2·s），光照強(qiáng)度過(guò)大抑制植株側(cè)芽數(shù)量。

2.2 光照強(qiáng)度對(duì)鐵皮石斛幼苗根系性狀的影響

相對(duì)于對(duì)照，T1、T2及T3處理均顯著提高了鐵皮石斛的單苗總根尖數(shù)（表2）。此外，T2處理還顯著提高了鐵皮石斛平均根直徑、單苗總根體積。但是，T2和T3處理比較，其對(duì)鐵皮石斛其它根系性狀（如：平均根直徑、單苗總根體積、單苗總根長(zhǎng)及單苗總根表面積等）均無(wú)顯著差異。因此，相對(duì)于常規(guī)組培光強(qiáng)條件，適當(dāng)高光照強(qiáng)度有利于改善鐵皮石斛植株根系生長(zhǎng)狀況，其中，效果最好的光照強(qiáng)度大小為75 μmol/（m2·s）。

2.3 光照強(qiáng)度對(duì)鐵皮石斛幼苗生理特性的影響

增大光強(qiáng)有降低鐵皮石斛葉片總含水量的趨勢(shì)，但處理間均無(wú)顯著差異（表3）。增大光強(qiáng)可提高鐵皮石斛葉片葉綠素含量（用SPAD值大小表示），其中，T2和T3處理均極顯著提高了鐵皮石斛葉片的葉綠素含量。增大光強(qiáng)還有利于提高鐵皮石斛葉片蔗糖合成酶活性，其中，T2和T3處理影響差異分別達(dá)顯著水平和極顯著水平。但是，T1、T2及T3處理則顯著降低了鐵皮石斛葉片的超氧化物歧化酶活性。

2.4 相關(guān)性分析

鐵皮石斛試管苗總根尖數(shù)與葉片葉綠素含量呈極顯著的正相關(guān)，且葉片葉綠素含量與葉片蔗糖合成酶活性呈極顯著的正相關(guān)（表4）；莖粗與總根尖數(shù)呈顯著正相關(guān)，與葉片葉綠素含量及蔗糖合成酶活性均呈極顯著正相關(guān)。然莖粗與葉片總含水量、超氧化物歧化酶活性均呈極顯著的負(fù)相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

光照條件是影響鐵皮石斛優(yōu)質(zhì)試管種苗形成的重要因素。適宜的光照時(shí)間（12 h/d）有利于提高鐵皮石斛組培苗的凈光合速率和葉綠素含量、增加干重和腋芽數(shù)，從而促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育[32]；適宜紅藍(lán)光的光質(zhì)配比調(diào)節(jié)葉綠素a/b的比值，有利于促進(jìn)試管苗的生長(zhǎng)發(fā)育[26]。有學(xué)者認(rèn)為組培室常用光強(qiáng)偏小可能是試管苗生長(zhǎng)發(fā)育的主要限制因子之一，本研究支持上述觀點(diǎn)。與傳統(tǒng)組培光強(qiáng)內(nèi)，莖粗和總根尖數(shù)是鐵皮石斛試管苗形態(tài)建成的重要農(nóng)藝指標(biāo)，直觀反映著種苗的外觀質(zhì)量，葉片葉綠素含量與其呈顯著或極顯著的正相關(guān)關(guān)系表明它可能是影響鐵皮石斛試管苗幼苗素質(zhì)的一項(xiàng)重要生理指標(biāo)。增大光強(qiáng)有利于提高葉片葉綠素含量，這可能歸因于較大光強(qiáng)下有較大的養(yǎng)分特別是氮素吸收能力[38]，而較大的氮素吸收能力又與良好的根系性狀息息相關(guān)；適宜范圍內(nèi)光強(qiáng)越大，葉片葉綠素含量和蔗糖合成酶活性越高，光合同化力越強(qiáng)對(duì)于增粗增重有良效，這和丑敏霞等[37]研究結(jié)果類似，進(jìn)一步解釋了光強(qiáng)影響優(yōu)質(zhì)幼苗形成的生理機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

[1] 王世林， 鄭光植， 何靜波， 等. 黑節(jié)草多糖的研究[J]. 云南植物研究， 1988（4）： 389-395.

[2] 黃民權(quán)， 阮金月. 6種石斛屬植物水溶性多糖的單糖組分分析[J]. 中國(guó)中藥雜志， 1997（2）： 10， 51.

[3] 楊 虹， 王順春， 王崢濤， 等. 鐵皮石斛多糖的研究[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志， 2004（4）： 18-20.

[4] 馬國(guó)祥， 徐國(guó)鈞， 徐珞珊， 等. 反相高效液相色譜法測(cè)定18種石斛類生藥中chrysotoxene， erianin及chrysotoxine的含量[J]. 中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)， 1994（2）： 103-105.

[5] 諸 燕， 苑 鶴， 李國(guó)棟， 等. 鐵皮石斛中11種金屬元素含量的研究[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2011（3）： 356-360.

[6] 黃民權(quán)， 蔡體育， 劉慶倫. 鐵皮石斛多糖對(duì)小白鼠白細(xì)胞數(shù)和淋巴細(xì)胞移動(dòng)抑制因子的影響[J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)， 1996（3）： 39-41.

[7] 張中建， 閻小偉. 鐵皮石斛制劑免疫調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā)， 2004（2）： 34-35.

[8] 李 欽， 陳愛(ài)君， 張信岳. 鐵皮石斛顆粒增強(qiáng)免疫功能作用研究[J]. 中藥藥理與臨床， 2008（1）： 53-54.

[9] Liu X F， Zhu J， Ren F Z， et al. Onrally administered Dendrobium officinale and its polysaccharides enhance immune functions in BALB/c mice[J]. Nat Prod Commun， 2011， 6（6）： 867-870.

[10] 羅慧玲， 蔡體育， 陳巧倫， 等. 石斛多糖增強(qiáng)臍帶血和腫瘤病人外周血LAK細(xì)胞體外殺傷作用的研究[J]. 癌癥， 2000（12）： 1 124-1 126.

[11] 何鐵光， 楊麗濤， 李楊瑞， 等. 鐵皮石斛原球莖多糖DCPP1a-1的理化性質(zhì)及抗腫瘤活性[J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)， 2007（4）： 578-583.

[12] 吳昊姝， 徐建華， 陳立鉆， 等. 鐵皮石斛降血糖作用及其機(jī)制的研究[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2004（2）： 69-72.

[13] 陳愛(ài)君， 李 欽， 張信岳， 等. 鐵皮石斛膏降糖作用的研究[J]. 中國(guó)中醫(yī)藥科技， 2009（6）： 457-458.

[14] Li B， Wei J M， Wei X L. Effect of sound wave stress on antioxidant enzyme activities and lipid peroxidation of Dendrobium candidum[J]. Colloids and Surfaces B： Biointerfaces， 2008， 63： 269-275.

[15] 鮑素華， 查學(xué)強(qiáng)， 郝 杰， 等. 不同分子量鐵皮石斛多糖體外抗氧化活性研究[J]. 食品科學(xué)， 2009（21）： 123-127.

[16] 楊兵勛， 于善凱， 孫繼軍， 等. 鐵皮石斛與大豆異黃酮提取物協(xié)同抗氧化作用評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)， 2009（11）： 885-887.

[17] 湯小華， 陳素紅， 呂圭源， 等. 鐵皮石斛對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷模型SOD、 MDA、 GSH-Px的影響[J]. 浙江中醫(yī)雜志， 2010（5）： 369-370.

[18] 李 玲， 鄧曉蘭， 趙興兵， 等. 鐵皮石斛化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J]. 腫瘤藥學(xué)， 2011（2）： 90-94.

[19] Zhao P， Wang W， Feng F S， et al. High-frequency choot regeneration through transverse thin cell layer culture in Dendrobium wall Ex Lindl[J]. Plant Cell， Tissue， and Organ Culture， 2007， 90： 131-139.

[20] 葉秀妹， 劉煒?gòu)O， 賴鐘雄. 鐵皮石斛組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J]. 亞熱帶農(nóng)業(yè)研究， 2012（1）： 57-61.

[21] 周雅琴， 余麗瑩， 譚小明. 鐵皮石斛組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)民族民間醫(yī)藥， 2012（1）： 48-49.

[22] 付傳明， 趙志國(guó)， 黃寧珍， 等. 鐵皮石斛無(wú)菌播種產(chǎn)業(yè)化繁育技術(shù)研究[J]. 廣西植物， 2012（2）： 238-242， 273.

[23] 李洪林， 昝艷燕， 楊 波. 鐵皮石斛的組織培養(yǎng)（簡(jiǎn)報(bào)）[J]. 亞熱帶植物科學(xué)， 2012（3）： 76-77.

[24] 楊柳平， 劉暢慶， 趙仁發(fā)， 等. 鐵皮石斛種子誘導(dǎo)原球莖組培快繁體系的研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012（7）： 54-57.

[25] 鄭慧俊， 張明麗， 鄒春晶， 等. 鐵皮石斛組織培養(yǎng)繁殖技術(shù)研究[J]. 農(nóng)業(yè)工程， 2012（11）： 49-51.

[26] 孫志蓉， 李 玥， 金家興， 等. 環(huán)草石斛和鐵皮石斛試管苗葉片氣孔特征的研究[A]. 中國(guó)商品學(xué)會(huì). 第二屆全國(guó)中藥商品學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C]. 中國(guó)商品學(xué)會(huì)， 2010： 8.

[27] Khoo G H， He J， Hew C S. Photosynthetic utilization of radiant energy by CAM Dendrobium flowers[J]. Photosynthetica， 1997， 34（3）： 367-376.

[28] 蘇文華， 張光飛. 鐵皮石斛葉片光合作用的碳代謝途徑[J]. 植物生態(tài)學(xué)報(bào)， 2003（5）： 631-637.

[29] 呂獻(xiàn)康， 徐春華， 舒小英. 3種石斛的光合特性研究[J].中草藥， 2004（11）： 100-102.

[30] 蔡永萍. 藥用石斛對(duì)光強(qiáng)適應(yīng)性及其種質(zhì)改良的研究[D]. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2005.

[31] 李桂鋒. 鐵皮石斛組培快繁工藝及規(guī)范化生產(chǎn)體系研究[D]. 廣州： 廣州中醫(yī)藥大學(xué)， 2008.

[32] 鮑順淑， 賀冬仙， 郭順星. 鐵皮石斛在人工光型密閉式植物工廠的適宜光照強(qiáng)度[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2007（3）： 469-473.

[33] 白美發(fā)， 黃 敏. 鐵皮石斛組培技術(shù)研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2008（36）： 15 802-15 803.

[34] 萬(wàn)惠燕， 劉嘉杰， 王金祥， 等.磷空間有效性對(duì)擬南芥根形態(tài)構(gòu)型的影響[J]. 植物生理學(xué)通訊， 2007， 43（3）： 425-429.

[35] 唐湘如， 余鐵橋.密度對(duì)飼用雜交稻幾種酶活性的影響及其與產(chǎn)量和蛋白質(zhì)含量的關(guān)系[J]. 雜交水稻， 2001， 16（6）： 47-50.

[36] 陳建勛， 王曉峰. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)論[M]. 廣州： 華南理工大學(xué)出版社， 2002： 119-123.

[37] 丑敏霞， 朱利泉， 張玉進(jìn)， 等. 不同光照強(qiáng)度和溫度對(duì)金釵石斛生長(zhǎng)的影響[J]. 植物生態(tài)學(xué)報(bào)， 2001（3）： 325-330.

[38] 張 明， 陳仕江， 萬(wàn)兆良， 等. 光照強(qiáng)度對(duì)金釵石斛吸收氮素的影響[J]. 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2000（2）： 108-111.

責(zé)任編輯：沈德發(fā)