楊志偉 王 玨 揭雅嬌 沈 旭 麻成金 黃 群

YANG Zhi－wei WANG Jue JIE Ya－jiao SHEN Xu MA Cheng－jinHUANG Qun

（吉首大學(xué)食品科學(xué)研究所，湖南 吉首 416000）

（Institute of Food Science，Jishou University，Jishou，Hunan 416000，China）

杜仲又名思仲、扯絲皮、思仙、思連木、木棉、玉絲皮、絲綿木等，屬杜仲科落葉喬木，是中國特有的經(jīng)濟(jì)樹種［1，2］。杜仲在中國分布比較廣，但主要分布在秦嶺以南的貴州、四川、湖南、湖北等省份，種植面積達(dá)35萬 hm2［3，4］。杜仲翅果，扁平，先端下，周圍長有薄翅，內(nèi)含種子1粒，扁平，線形長1.2～1.5 cm，寬3 cm［5］。杜仲翅果籽是提取杜仲油、杜仲膠的最佳原料，經(jīng)提油、提膠后產(chǎn)生的籽粕中含豐富的蛋白質(zhì)，含量約為28%～35%［6］。目前，對于杜仲翅果籽粕蛋白的研究較少，在一定程度上造成了杜仲翅果籽粕資源的浪費(fèi)。黃群等［7］采用堿法提取杜仲翅果籽蛋白，提取率達(dá)到87.31%，但提取時(shí)間長、蛋白純度低。微波作為一種新型的輔助提取手段，與傳統(tǒng)的提取方法相比具有較高的選擇性、萃取效率高、節(jié)約能源等優(yōu)點(diǎn)［8，9］。將微波用于杜仲翅果籽粕蛋白的提取，既可提高產(chǎn)品純度，縮短提取時(shí)間，還可彌補(bǔ)在該領(lǐng)域的空白。本課題主要探討微波輔助堿提法提取杜仲翅果籽粕中的提取條件，為合理利用和開發(fā)這一資源提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

杜仲翅果籽粕：杜仲翅果籽經(jīng)超臨界CO2萃取油脂后的粕粉，經(jīng)凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量為34.94%，湘西老爹生物公司；

凱氏定氮儀：KDN系列，浙江托普儀器有限公司；

數(shù)顯恒溫磁力攪拌器：HJ－3型，常州澳華儀器有限公司；

微波萃取儀：BXG1－XH－100B型，北京中西化玻儀器有限公司；

p H計(jì)：PHSJ－4A型，上海雷磁儀器廠；

離心機(jī)：LXJ－IIB型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

電子天平：FA2003型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

杜仲翅果籽粕→加浸提液→調(diào)p H值→微波處理→上清液離心→調(diào)p H至等電點(diǎn)→離心分離→蛋白質(zhì)沉淀→冷凍干燥→蛋白產(chǎn)品

1.2.2 提取方法 取杜仲翅果籽粕5.0 g，以一定料液比加入蒸餾水，用0.1 mol／L NaOH溶液調(diào)p H 值，置于微波萃取儀中處理。離心（5 000 r／min，15 min）過濾，所得上清液即為杜仲翅果籽粕蛋白提取液。以0.1 mol／L稀鹽酸調(diào)上清液至蛋白完全沉淀，將所得沉淀真空冷凍干燥即得杜仲翅果籽粕蛋白。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 利用微波輔助堿提法，通過單因素試驗(yàn)分別考察p H值、料液比、微波功率、微波作用時(shí)間對杜仲蛋白提取率的影響。確定最適范圍后，利用Central－Composite組合設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面試驗(yàn)優(yōu)化提取條件。其單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)：

（1）提取液p H值對蛋白質(zhì)提取率的影響：在料液比1∶25（m∶V）、超聲波功率300 W、微波時(shí)間240 s的條件下，考察不同p H 值（7，8，9，10，11）對蛋白質(zhì)提取率的影響，以確定其因素取值范圍。

（2）料液比對蛋白質(zhì)提取率的影響：在p H 9.0、微波功率300 W、微波時(shí)間240 s的條件下，考察不同料液比（1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35（m∶V））對蛋白質(zhì)提取率的影響，以確定其因素取值范圍。

（3）微波功率對蛋白質(zhì)提取率的影響：在p H 9.0、料液比1∶25（m∶V）、微波時(shí)間240 s的條件下，考察不同微波功率（120，180，240，300，360 W）對蛋白質(zhì)提取率的影響，以確定其因素取值范圍。

（4）微波時(shí)間對蛋白質(zhì)提取率的影響：在p H 9.0、料液比1∶25（m∶V）、微波功率300 W的條件下，考察不同微波時(shí)間（80，160，240，320，400 s）對蛋白質(zhì)提取率的影響，以確定其因素取值范圍。

1.2.4 蛋白質(zhì)提取率的測定

（1）提取液蛋白質(zhì)含量的測定：采用考馬斯亮藍(lán)G－250法［10］。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確吸取牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入考馬斯亮藍(lán)G－250溶液，通過可見光分光光度法，以吸光度為縱坐標(biāo)Y，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量（μg／m L）為橫坐標(biāo)X，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve

（3）蛋白質(zhì)提取率計(jì)算：按式（1）計(jì)算。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)由 Design－expert8.0.5軟件處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 微波輔助堿提－響應(yīng)面因素的確定

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采用Central－Composite設(shè)計(jì)，對p H值、料液比、微波功率、微波時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，各試驗(yàn)組的編碼及取值見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平表Table 1 Factors and levels of Response Surface Method

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)及方差分析

利用Design Expert 8.0.5軟件對表2進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析，得到如下多元二次響應(yīng)面回歸模型：

表3是響應(yīng)面模型的方差分析結(jié)果。由表3可知，模型P值＜0.000 1，說明模型極顯著，即試驗(yàn)數(shù)據(jù)與所采用的二次數(shù)學(xué)模型符合。失擬項(xiàng)P＝0.124 3＞0.05不顯著，R2＝0.990 8，表明回歸方程的擬合程度較好，試驗(yàn)誤差小，可以用該模型分析和預(yù)測微波輔助提取杜仲翅果籽粕蛋白的工藝結(jié)果。依據(jù)回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知：模型一次項(xiàng)A、B、C、D極顯著；二次項(xiàng) A2、B2、C2、D2均處于顯著水平；交互項(xiàng)AC極顯著，AB顯著，AD、BC、BD、CD均不顯著。

2.3 響應(yīng)曲面分析與工藝優(yōu)化

等值線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。由圖2可知，當(dāng)p H一定時(shí)，蛋白質(zhì)提取率隨著料液比的增加呈現(xiàn)出先增加后減小的趨勢；當(dāng)料液比一定時(shí)，蛋白質(zhì)提取率隨著p H的增大先增大而后趨于平緩；其等值線趨于橢圓，說明p H與料液比的交互作用顯著。由圖3可知，當(dāng)p H一定時(shí)，蛋白質(zhì)提取率隨著微波功率的增加而增加，當(dāng)微波功率達(dá)到一定值時(shí)，蛋白質(zhì)提取隨著微波功率的增大而呈現(xiàn)下降趨勢；當(dāng)微波功率一定時(shí)，蛋白質(zhì)提取率隨著p H的增大而先增大后趨于平緩；二者之間的等值線呈橢圓狀，說明p H與微波功率交互作用顯著。

表2 Central－Composite設(shè)計(jì)試驗(yàn)及結(jié)果Table 2 Design and results of Central－Composite experiment

對二次多項(xiàng)回歸方程（式（2））取一階偏導(dǎo)等于零。解得：A ＝0.54，B ＝ －0.29，C ＝0.09，D ＝0.07，即p H 值9.54，料液比1∶21.45（m∶V），微波功率305.40 W，微波時(shí)間245.60 s?？紤]到試驗(yàn)的實(shí)際操作，微波輔助堿提法提取杜仲翅果籽粕蛋白的最佳條件為p H 9.5，料液比1∶22（m∶V），微波功率305 W，微波時(shí)間246 s，在該工藝條件下，模型預(yù)測蛋白質(zhì)的提取率為60.34%。為了進(jìn)一步驗(yàn)證杜仲翅果籽蛋白最優(yōu)的微波輔助提取工藝，采用上述工藝條件進(jìn)行了3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果蛋白質(zhì)平均提取率為60.30%，與理論值基本一致。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

＊＊表示極顯著（P＜0.01）；＊表示顯著（0.01＜P＜0.05）。

來源 離差平方和自由度 均方 F值 P值 顯著性模型 629.30 14 44.95 115.55 ＜0.000 1 ＊＊A 65.86 1 65.86 169.29 ＜0.000 1 ＊＊B 33.73 1 33.73 86.70 ＜0.000 1 ＊＊C 9.72 1 9.72 25.00 0.000 2 ＊＊D 6.54 1 6.54 16.81 0.000 9 ＊＊AB 2.12 1 2.12 5.46 0.033 7 ＊AC 4.48 1 4.48 11.53 0.004 0 ＊＊AD 0.86 1 0.86 2.21 0.157 7 BC 0.018 1 0.018 0.045 0.834 6 BD 0.072 1 0.072 0.18 0.674 1 CD 0.44 1 0.44 1.13 0.305 0 A 2 6.80 1 6.80 17.49 0.000 8 ＊＊B2 10.52 1 10.52 27.05 0.000 1 ＊＊C2 15.05 1 15.05 38.69 ＜0.000 1 ＊＊D2 28.91 1 28.91 74.31 ＜0.000 1 ＊＊失擬項(xiàng) 4.98 10 0.50 2.92 0.124 3殘差 0.85 5 0.17總和 635.14 29

圖2 p H（A）與料液比（B）對蛋白質(zhì)提取率（Y）影響的響應(yīng)面與等值線Figure 2 Response surface and contours of the effect of p H values and ratio of material to liquid on protein extraction yield

圖3 p H（A）與微波功率（C）對蛋白質(zhì)提取率（Y）影響的響應(yīng)面與等值線Figure 3 Response surface and contours of the effect of p H values and microwave power on protein extraction yield

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)，確定各因素的最適范圍，利用中心組合設(shè)計(jì)－響應(yīng)面分析法對p H值、料液比、微波功率、微波時(shí)間4個(gè)因素對杜仲蛋白提取率的影響進(jìn)行分析。最終確定微波輔助提取的最適條件為p H 9.5，料液比1∶22（m∶V），微波功率305 W，微波時(shí)間246 s。該工藝條件下的杜仲翅果籽粕蛋白質(zhì)提取率為60.30%。該工藝與傳統(tǒng)方法［7］相比，提取率有所下降，可能是溫度的瞬間升高而使蛋白質(zhì)變性。采用微波輔助堿法提取杜仲翅果籽粕蛋白，提取時(shí)間短，效率高，且操作簡易。但提取過程中酸堿的使用對蛋白質(zhì)的純度和質(zhì)量均有一定不良影響，杜仲翅果籽粕中含量豐富的桃葉珊瑚甙對杜仲蛋白顏色的影響也尤為顯著。因此制取純度高色澤好的杜仲翅果籽粕蛋白，須去除原料中的桃葉珊瑚甙并對提取的粗蛋白進(jìn)行透析處理。

1 艾倫強(qiáng)，李婷婷，何銀生，等.杜仲的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2010，6（10）：163～165.

2 劉慧，劉仲華，張盛.杜仲中活性成分的研究進(jìn)展［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工，2011（8）：12～18.

3 劉寧，栗克喜，劉春山.杜仲國內(nèi)外研究進(jìn)展［J］.西南國防醫(yī)藥，2002，12（15）：449～451.

4 楊凌，張碧.中國杜仲資源的綜合利用［J］.廣州化工，2011，39（24）：9～10.

5 鄧金星.杜仲翅果主要有效成分提取工藝的研究［J］.龍巖學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，23（3）：91～92.

6 張永康，陳功錫，申緒湘，等.杜仲翅果綜合開發(fā)利用研究現(xiàn)狀與展望［C］／／譚寧華.第十屆全國藥用植物及植物藥學(xué)術(shù)研討會論文摘要集.昆明：第十屆全國藥用植物及植物藥學(xué)術(shù)研討會組織委員會，2011：179.

7 黃群，楊萬根，余佶，等.杜仲籽粕蛋白酶解制備抗氧化肽工藝優(yōu)化［J］.食品科學(xué)，2013，34（17）：205～209.

8 李遠(yuǎn)虎，王華.微波輔助提取紅橘種子蛋白質(zhì)的研究［J］.食品與發(fā)酵科技，2010，46（1）：82～84，99.

9 蘇慧，鄭明珠，蔡丹，等.微波輔助技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用研究展［J］.食品與機(jī)械，2011，27（2）：165～167.

10 趙英永，戴云，崔秀明，等.考馬斯亮藍(lán)G－250染色法測定草烏中可溶性蛋白質(zhì)含量［J］.云南民族大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，15（3）：235～237.