張惠喜，宋紅衛(wèi)，肖 猛，孫啟亮，袁國良

（菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，山東 菏澤274000）

油用牡丹是我國新型的木本油料植物，2011年國家衛(wèi)生部批準(zhǔn)牡丹籽油為新資源食品[1]。牡丹籽粕是壓榨牡丹籽油的副產(chǎn)物，在牡丹籽油制備過程中牡丹籽粕產(chǎn)出率為25%～30%[2]，每年大量用于榨油后的牡丹籽粕被廢棄，經(jīng)檢測牡丹籽粕中蛋白質(zhì)含量在30%左右，而且氨基酸種類全面，可以開發(fā)為一種蛋白質(zhì)飼料原料[3-4]。

研究表明，生物機(jī)體對蛋白質(zhì)的吸收并不全是以氨基酸形式，小分子多肽因具有重要的生理功效而被機(jī)體吸收利用[5]。通過水解蛋白質(zhì)可以得到易于機(jī)體消化吸收的小分子多肽，由于酸或堿水解法對蛋白質(zhì)破壞程度大，一般不用于制備蛋白質(zhì)水解產(chǎn)品[6]，而酶水解法作用條件溫和，能夠保持蛋白質(zhì)的活性，常常用于制備具有生物活性的多肽類產(chǎn)品[7]。

本試驗(yàn)利用堿性蛋白酶水解牡丹籽粕制備蛋白質(zhì)多肽飼料產(chǎn)品，以期為牡丹籽粕在畜禽養(yǎng)殖上的利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 原料與試劑

牡丹籽粕，菏澤天寶牡丹有限公司產(chǎn)品；堿性蛋白酶（批號為S101054），上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；氫氧化鈉、鹽酸等，均分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

K9870型凱氏定氮儀，濟(jì)南海能儀器股份有限公司產(chǎn)品；SHA-C型水浴恒溫振蕩器，天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠產(chǎn)品；SK15型離心機(jī)，Sigma公司產(chǎn)品；FE20K型臺式酸度計(jì)，梅特勒-托利公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 牡丹籽粕多肽的提取工藝流程

按1：20（W/V）的料液比配制牡丹籽粕懸混液，用1.0 mol·L-1HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH至設(shè)定值，加入設(shè)定比例的堿性蛋白酶，于水浴中恒溫酶解。在此期間不斷加入0.5 mol·L-1NaOH以保持溶液的pH不變，并記錄NaOH溶液的消耗量。反應(yīng)完成后，將酶解液于95℃沸水浴中滅活10 min，冷卻至室溫，再6 000 r·min-1離心10 min，過濾后即得牡丹籽粕酶解多肽。

2.2 牡丹籽粕蛋白水解度的測定

根據(jù)pH-state法[8]計(jì)算牡丹籽粕蛋白水解度（DH）。具體公式如下[9]：

式 中：C為NaOH溶 液 濃 度（mol·L-1），V為NaOH溶液消耗體積（mL），α為氨基的離解度；m為樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量（g），h為每克原料牡丹籽粕蛋白中肽鍵的毫摩爾數(shù)，h=7.84 mmol·g-1，T為試驗(yàn)溫度（K）。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 溫度對牡丹籽粕蛋白酶解效果影響

按1：20（W/V）的料液比配制牡丹籽粕懸混液，用1.0 mol·L-1HCl或NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH=7.5，加入1.0%的堿性蛋白酶，分別在50℃、55℃、60℃、65℃水浴鍋中保溫酶解2.0 h，期間不斷加入0.5 mol·L-1的NaOH溶液以保持溶液的pH不變，記錄消耗的加堿量，分析酶解溫度對牡丹籽粕蛋白酶解效果的影響。

2.3.2 pH對牡丹籽粕蛋白酶解效果的影響

按1：20（W/V）的料液比配制牡丹籽粕懸混液，在60℃水浴鍋中保溫，加入1.0%的堿性蛋白酶，用1.0 mol·L-1HCl或NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH分別為6.5、7.0、7.5、8.0，酶解2.0 h，期間不斷加入0.5 mol·L-1NaOH以保持溶液的pH不變，記錄消耗的堿量，分析pH對牡丹籽粕蛋白酶解效果的影響。

2.3.3 酶濃度對牡丹籽粕蛋白酶解效果的影響

按1：20（W/V）的料液比配制牡丹籽粕懸混液，用1.0 mol·L-1HCl或NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH=7.5，并在60℃水浴鍋中保溫，分別加入濃度為0.6%、0.8%、1.0%、1.2%的堿性蛋白酶，酶解2.0 h，期間不斷加入0.5 mol·L-1NaOH以保持溶液的pH不變，記錄消耗的堿量，分析酶濃度對牡丹籽粕蛋白酶解效果的影響。

2.3.4 反應(yīng)時(shí)間對牡丹籽粕蛋白酶解效果的影響

按1：20（W/V）的料液比配制牡丹籽粕懸混液，用1.0 mol·L-1HCl或NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH=7.5，并在60℃水浴鍋中保溫，此時(shí)加入1.0%的堿性蛋白酶，分別酶解1.0 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h，期間不斷加入0.5 mol·L-1NaOH以保持溶液的pH不變，記錄消耗的加堿量，分析反應(yīng)時(shí)間對牡丹籽粕蛋白酶解工藝的影響。

2.4 正交試驗(yàn)確定最佳工藝條件

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以水解度為指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1 溫度對牡丹籽粕蛋白酶解效果的影響

溫度是影響蛋白酶解最重要的因素之一，過高或過低均會(huì)影響酶的活力，進(jìn)而影響酶解過程。當(dāng)溫度升高時(shí)，反應(yīng)速度也加快，另一方面，溫度過高也會(huì)使蛋白質(zhì)變性沉降，阻礙蛋白質(zhì)與酶的接觸，從而影響酶解效果[10]。本試驗(yàn)中，隨著酶解溫度從50℃升高到60℃時(shí)，牡丹籽粕蛋白DH逐漸升高，從開始的10.02%增大到17.25%，當(dāng)酶解溫度超過60℃后，DH逐漸降低，酶解溫度從60℃升高到65℃時(shí)，牡丹籽粕蛋白DH從17.25%降低到14.36%，結(jié)果見圖1。

3.1.2 pH對牡丹籽粕蛋白酶解效果的影響

堿性蛋白酶的活性很大程度上取決于pH，因?yàn)閜H能顯著影響堿性蛋白酶活性位點(diǎn)的氨基酸電離狀態(tài)，而且在維持酶的正常構(gòu)象方面起著重要作用[11-12]。本試驗(yàn)中，隨著酶解液pH從6.5增加到7.5，牡丹籽粕蛋白的DH從8.08%增大到19.53%，當(dāng)pH值從7.5繼續(xù)增加到8.0時(shí)，牡丹籽粕蛋白DH從19.53%顯著降低到14.40%，結(jié)果見圖2。

圖1 不同酶解溫度下牡丹籽粕的蛋白酶解度

圖2 不同pH時(shí)牡丹籽粕的蛋白酶解度

3.1.3 酶濃度對牡丹籽粕蛋白酶解效果的影響

蛋白酶解時(shí)，底物濃度確定時(shí)，隨著酶濃度的增加，水解度隨著提高，當(dāng)酶濃度超過一定量時(shí)，DH趨于平緩。本試驗(yàn)中，隨著酶濃度從0.6%增加到1.0%，牡丹籽粕蛋白DH從12.58%增加到17.84%，當(dāng)酶濃度從1.0%繼續(xù)增加到1.2%時(shí)，牡丹籽粕蛋白DH從17.84%變?yōu)?7.90%，結(jié)果見圖3。

圖3 不同酶濃度下牡丹籽粕蛋白的酶解度

3.1.4 反應(yīng)時(shí)間對牡丹籽粕蛋白酶解效果的影響

本試驗(yàn)中，隨著反應(yīng)時(shí)間從1 h增大到3 h，牡丹籽粕蛋白DH從8.24%顯著地增加到15.86%，再繼續(xù)增加反應(yīng)時(shí)間，牡丹籽粕蛋白DH趨于平穩(wěn)，可能3 h的反應(yīng)時(shí)間已經(jīng)能夠確保底物與酶充分反應(yīng)，再繼續(xù)延長反應(yīng)時(shí)間，DH的變化幅度很小，結(jié)果見圖4。

圖4 不同反應(yīng)時(shí)間時(shí)牡丹籽粕的蛋白酶解度

3.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝

結(jié)果見表2和表3。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及牡丹籽粕蛋白DH測定結(jié)果

表3 牡丹籽粕蛋白DH方差分析結(jié)果

由表2、表3方差分析結(jié)果可知，溫度、pH、酶濃度對牡丹籽粕蛋白水解度的影響差異極顯著（P＜0.01），反應(yīng)時(shí)間對牡丹籽粕蛋白水解度的影響差異顯著（P＜0.05）；影響因素主次順序?yàn)閜H＞酶解溫度＞酶濃度＞反應(yīng)時(shí)間。最佳酶解工藝組合為pH=7.5、酶解溫度60℃，酶濃度為1.2%，反應(yīng)時(shí)間為3 h。

4 結(jié) 論

牡丹籽粕是壓榨牡丹籽油的副產(chǎn)物，由于對牡丹籽粕的研究主要集中在其化學(xué)成分方面，因此大量榨油后的牡丹籽粕被廢棄。研究表明，在肉雞飼料中添加一定比例牡丹籽粕，能顯著提高21 d肉雞血漿IgG、IgM含量（P＜0.05）；在產(chǎn)蛋雞飼料中添加5%牡丹籽粕能夠提高蛋殼質(zhì)量、蛋黃等級、蛋白高度、哈氏單位[13]。牡丹籽粕蛋白質(zhì)含量為30%左右，且是一種營養(yǎng)健康安全的植物蛋白。小肽能夠促進(jìn)動(dòng)物腸道系統(tǒng)的早期快速發(fā)育，對患有胃腸疾病動(dòng)物的營養(yǎng)吸收、維護(hù)腸道健康、補(bǔ)充動(dòng)物在快速生長期和高產(chǎn)期對氨基酸的需求具有重要意義[14]，將牡丹籽粕蛋白降解為更容易被吸收利用的小肽同時(shí)可解決適口性問題。本試驗(yàn)借鑒大豆肽的生產(chǎn)工藝，采用堿性蛋白酶直接酶解牡丹籽粕蛋白，制備牡丹籽粕小肽飼料。通過單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)對影響牡丹籽粕蛋白酶解的因素進(jìn)行考察，獲得最佳工藝條件為：pH=7.5，酶解溫度為60℃，酶濃度為1.2%，反應(yīng)時(shí)間為3.0 h，牡丹籽粕蛋白水解度為17.18%。